蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途技术

本发明专利技术属于免疫学、生物医学领域，具体涉及一种蛋白‑细胞偶联物，其特征在于，所述蛋白与细胞通过双功能交联剂偶联。本发明专利技术还涉及所述蛋白‑细胞偶联物的制备方法和用途。本发明专利技术的蛋白‑细胞偶联物可用于预防或治疗多种疾病，例如恶性肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等。

【技术实现步骤摘要】
蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途本分案申请是中国专利申请号为201310234603.3、申请日为2013年6月14日、专利技术名称为“蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途”的中国专利申请案的分案申请。
本专利技术属于免疫学、生物医学领域，涉及一种偶联物，特别是蛋白与细胞的偶联物，本专利技术还涉及所述蛋白-细胞偶联物的制备方法和用途。
技术介绍
肿瘤的发生发展与免疫监视功能的减退有关，而某些感染可通过给予病原微生物疫苗而使感染得到有效的预防，对于自身免疫耐受被打破的自身免疫病则可通过免疫调节或免疫耐受的诱导而重新恢复免疫耐受。所有这些免疫干预措施都与抗原或抗体有关，而绝大多数抗原或抗体是蛋白质，因此，诱导对抗原蛋白的免疫反应或免疫耐受或者充分利用抗体的靶向性是上述免疫干预措施的目的。如何将抗原蛋白高效地输送到淋巴组织是实现上述免疫干预的关键。如果能将抗原蛋白有效牢固地偶联到具有免疫功能的细胞表面，由于免疫细胞有向淋巴组织迁移定位的特性或者提呈抗原的特性，通过输注免疫细胞即可把蛋白抗原有效地输送到淋巴组织或更好的提呈。或者可以利用抗体的靶向性将免疫效应细胞锚定靶细胞，以提高免疫效应细胞的杀伤效率。已有的偶联蛋白到细胞膜上的方法是用碳化二亚胺乙烯(EthyleneCarbodiimide,ECDI)将一种已知抗原通过使细胞固定将抗原偶联到细胞表面(luo,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2008Sep23；105(38):14527-32.；SmarrCB,etal.Antigen-fixedleukocytestolerizeTh2responsesinmousemodelsofallergy.JImmunol.2011Nov15；187(10):5090-8.)。此方法制备的的细胞因被ECDI固定而死亡，根据上述文献报道，输注这种细胞只能引起抗原特异性免疫耐受而不能诱导对抗原的免疫应答。因此，本领域亟需一种将蛋白偶联到活细胞上的方法，以期更有效地诱导免疫应答，用于感染、肿瘤等的预防或治疗。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人经过长期、大量的实验研究，令人惊奇地发现利用双功能交联剂可以将蛋白与细胞偶联在一起，并且保持蛋白和细胞的活性，由此完成了本专利技术。本专利技术第一方面涉及蛋白-细胞偶联物，其为蛋白和细胞分别与连接接头共价连接形成的偶联物；优选地，所述细胞在未偶联时，其表面分布着游离的巯基；优选地，所述的连接接头来源于双功能交联剂，所述双功能交联剂同时含有能与氨基发生反应的基团和与巯基发生反应的基团。根据本专利技术第一方面任一项的蛋白-细胞偶联物，其中所述细胞为具有免疫功能的细胞；优选地，所述细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞中的至少一种。在本专利技术的实施方案中，所述细胞为淋巴细胞，所述淋巴细胞例如为T淋巴细胞或B淋巴细胞。根据本专利技术第一方面任一项的蛋白-细胞偶联物，其中所述的连接接头来源于双功能交联剂。在本专利技术的具体实施方案中，其中所述的双功能交联剂同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团。在本专利技术的具体实施方案中，只要是同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团的化合物均可以实现本专利技术，在本专利技术的具体实施方案中，其包括但不限于琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)，SMCC的长链类似物N－琥珀酰亚氨基－4－(N－马来酰亚氨基甲基)－环己烷－1－羧基－(6－酰氨基己酸酯)(LC－SMCC)、κ－马来酰亚氨基十一酸N－琥珀酰亚氨基酯(KMUA)、γ－马来酰亚氨基丁酸N－琥珀酰亚氨基酯(GMBS)、ε－马来酰亚氨基己酸N－羟基琥珀酰亚氨基酯(EMCS)、间－马来酰亚氨基苯甲酰基－N－羟基琥珀酰亚氨酯(MBS)、N－(α－马来酰亚氨基乙酰氧基)－琥珀酰亚氨酯(AMAS)、琥珀酰亚氨基－6－(β－马来酰亚氨基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)或4－(对－马来酰亚氨基苯基)－丁酸N－琥珀酰亚氨基酯(SMPB)。根据本专利技术第一方面任一项的蛋白-细胞偶联物，其中所述双功能交联剂的琥珀酰亚氨基与蛋白上的游离氨基反应形成酰胺键，所述双功能交联剂的马来酰亚氨基与细胞上的游离巯基反应形成硫醚键。根据本专利技术第一方面任一项的蛋白-细胞偶联物，其中所述的蛋白包括但不限于抗原蛋白(例如肿瘤相关抗原、感染性疾病相关抗原、自身免疫性疾病相关抗原)、抗原表位、抗体、激素、生长因子、维生素、集落刺激因子。在本专利技术的一个实施方案中，所述的蛋白为雪蓝蛋白(KLH)；在本专利技术的另一个实施方案中，所述的蛋白为胰岛素。本专利技术第二方面涉及蛋白-细胞偶联物的制备方法，其包括以下步骤：(1)将蛋白与双功能交联剂接触，以使双功能交联剂的连接基团与蛋白发生共价连接，得到第一混合物，该混合物包含结合了连接基团的蛋白；(2)任选地，还包括去除第一混合物中未连接的双功能交联剂的步骤，以得到纯化的结合了连接基团的蛋白；(3)将步骤(1)或(2)获得的结合了连接基团的蛋白与细胞接触，以使所述连接基团与细胞发生共价连接，得到第二混合物，该混合物包含了分别与连接接头共价连接的蛋白和细胞偶联物，即蛋白-细胞偶联物；(4)任选地，还包括去除第二混合物中未与细胞连接的蛋白的步骤，以得到纯化的包含有蛋白-细胞偶联物的第二混合物；或者所述制备方法包括以下步骤：(a)将细胞与双功能交联剂接触，以使双功能交联剂的连接基团与细胞发生共价连接，得到第一混合物，该混合物包含结合了连接基团的细胞；(b)任选地，还包括去除第一混合物中未连接的双功能交联剂的步骤，以得到纯化的结合了连接基团的细胞；(c)将步骤(a)或(b)获得的结合了连接基团的细胞与蛋白接触，以使所述连接基团与蛋白发生共价连接，得到第二混合物，该混合物包含了分别与连接接头共价连接的蛋白和细胞偶联物，即蛋白-细胞偶联物；(d)任选地，还包括去除第二混合物中未与细胞连接的蛋白的步骤，以得到纯化的包含有蛋白-细胞偶联物的第二混合物；优选地，所述细胞在未偶联时，其表面分布着游离的巯基；优选地，所述的双功能交联剂同时含有能与氨基发生反应的基团和与巯基发生反应的基团。根据本专利技术第二方面任一项的制备方法，其中所述细胞为具有免疫功能的细胞；优选地，所述细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞中的至少一种。在本专利技术的实施方案中，其中所述的双功能交联剂同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团。只要是同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团的化合物均可以实现本专利技术。在本专利技术的具体实施方案中，所述的双功能交联剂包括但不限于其中所述的双功能交联剂选自琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)，SMCC的长链类似物N－琥珀酰亚氨基－4－(N－马来酰亚氨基甲基)－环己烷－1－羧基－(6－酰氨基己酸酯)(LC－SMCC)、κ－马来酰亚氨基十一酸N－琥珀酰亚氨基酯(KMUA)、γ－马来酰亚氨基丁酸N－琥珀酰亚氨基酯(GMBS)、ε－马来酰亚氨基己酸N－羟基琥珀酰亚氨基酯(EMCS)、间－马来酰亚氨基苯甲酰基－N－羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N－(α－马来酰亚氨基乙酰氧基)－琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚氨基－6－(β－马来酰亚氨基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)或4－(对－马来本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白‑细胞偶联物的用途，所述蛋白‑细胞偶联物能够有效诱导免疫应答，所述蛋白‑细胞偶联物用于预防或治疗以下疾病中的一项或多项：(1)与所述蛋白‑细胞偶联物中的蛋白相关的疾病；(2)恶性肿瘤；(3)病原微生物感染性疾病；(4)自身免疫性疾病；所述蛋白‑细胞偶联物为蛋白和细胞分别与连接接头共价连接形成的偶联物，所述细胞在未偶联时，其表面分布着游离的巯基；所述的连接接头来源于双功能交联剂，所述双功能交联剂同时含有能与氨基发生反应的基团和与巯基发生反应的基团；其中所述细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种，并且其中所述的蛋白选自肿瘤相关抗原蛋白、感染性疾病相关抗原蛋白或自身免疫性疾病相关抗原蛋白，其中所述的双功能交联剂同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团，其中所述双功能交联剂的琥珀酰亚氨基与蛋白上的游离氨基反应形成酰胺键，所述双功能交联剂的马来酰亚氨基与细胞上的游离巯基反应形成硫醚键。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白-细胞偶联物的用途，所述蛋白-细胞偶联物能够有效诱导免疫应答，所述蛋白-细胞偶联物用于预防或治疗以下疾病中的一项或多项：(1)与所述蛋白-细胞偶联物中的蛋白相关的疾病；(2)恶性肿瘤；(3)病原微生物感染性疾病；(4)自身免疫性疾病；所述蛋白-细胞偶联物为蛋白和细胞分别与连接接头共价连接形成的偶联物，所述细胞在未偶联时，其表面分布着游离的巯基；所述的连接接头来源于双功能交联剂，所述双功能交联剂同时含有能与氨基发生反应的基团和与巯基发生反应的基团；其中所述细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种，并且其中所述的蛋白选自肿瘤相关抗原蛋白、感染性疾病相关抗原蛋白或自身免疫性疾病相关抗原蛋白，其中所述的双功能交联剂同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团，其中所述双功能交联剂的琥珀酰亚氨基与蛋白上的游离氨基反应形成酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏长青，郭轶先，万岁桂，
申请(专利权)人：加思葆北京医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11