本发明专利技术涉及一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，属于生物工程及基因工程技术领域。本发明专利技术以以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD‑GDH)基因作为目的基因，以pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒作为表达载体，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，构建了一种可高效表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的基因工程菌；采用此菌摇瓶发酵生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶，可使胞内酶活高达3626U/L。
【技术实现步骤摘要】
一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌
本专利技术涉及一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，属于生物工程及基因工程
技术介绍
葡萄糖氧化还原酶是一类催化葡萄糖氧化还原反应的酶，常被用于开发传感器或检测试剂盒。它根据电子受体的差异，可分为葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中，葡萄糖氧化酶是葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器中应用最广泛的原料用酶，但其催化活性易受溶解氧的限制，会造成测量误差。近些年，研究发现葡萄糖脱氢酶不以氧气为电子受体不受溶解氧的限制，用于检测葡萄糖检测结果误差更小，具有替代葡萄糖氧化酶的应用潜力。葡萄糖脱氢酶按照辅基或辅酶类型可分为四类：以NADP+为辅酶的葡萄糖六磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49简称G6PDH)；以NAD+为辅酶的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47简称NAD-GDH)；以PQQ为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2简称PQQ-GDH)以及以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.10简称FAD-GDH)。其中，G6PDH和NAD-GDH的辅因子结合不紧密，催化过程中需要不断添加辅酶；PQQ-GDH热稳定性差，底物谱较广，除葡萄糖外还能以多种单糖和二糖为底物，上述缺陷均大大限制了G6PDH、NAD-GDH以及PQQ-GDH在检测血糖方面的应用；而FAD-GDH具有热稳定性好，催化效率高，辅基结合紧密等优势，是替代目前诊断用葡萄糖氧化酶的首选。然而，FAD-GDH在菌中分泌极少，因此，想达到FAD-GDH的工业生产仍存在很多问题。目前，已经有研究试图通过构建基因工程菌以提高FAD-GDH在菌中的分泌量，如：杨愈峰等人将来源于土曲霉的FAD-GDH基因在Pichiapastoris中进行表达，通过表达筛选及15L发酵罐发酵，上清酶活达2.6×105U/L，但在酵母菌中表达的异源葡萄糖脱氢酶存在糖基化修饰，会干扰血糖检测电极的灵敏度，实际生产应用中需进行酶的去糖基化步骤；周立伟等人筛选克隆出来源于青霉的FAD-GDH基因在E.coliBL21中表达，但表达出的蛋白大部分为包涵体；周立伟等人也尝试将筛选克隆出来源于青霉的FAD-GDH基因在毕赤酵母中表达，但表达量较低，仅为1×10-4U/L，上述工程菌分泌得到的蛋白在纯化和放大生产中均存在较大的缺陷。因此，如何找到一种既能够提高FAD-GDH在菌中的分泌量，又不影响分泌得到的蛋白质量的方法仍需进一步试验。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因作为目的基因，以pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒作为表达载体，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为表达宿主，构建了一种可高效表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的基因工程菌；采用此菌摇瓶发酵生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶，可使胞内酶活高达3626U/L。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；在本专利技术的一种实施方式中，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了PamyQ’启动子的pMA5质粒或插入了P43启动子的pMA5质粒或插入了PgsiB启动子的pMA5质粒或插入了Popuaa启动子的pMA5质粒或插入了移除cre位点的PamyQ’启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；所述cre位点是指启动子上游的一段具有回文结构的保守序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子的插入位点在pMA5质粒自带的PHpaⅡ启动子的下游。在本专利技术的一种实施方式中，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因来源于洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)。在本专利技术的一种实施方式中，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。在本专利技术的一种实施方式中，所述PamyQ’启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。在本专利技术的一种实施方式中，所述PamyQ’启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述P43启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。在本专利技术的一种实施方式中，所述P43启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.3。在本专利技术的一种实施方式中，所述PgsiB启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。在本专利技术的一种实施方式中，所述PgsiB启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.4。在本专利技术的一种实施方式中，所述Popuaa启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。在本专利技术的一种实施方式中，所述Popuaa启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述cre位点的核苷酸序列为SEQIDNO.6：TGWAARCGYTWNCW，其中，W为碱基A或T，R为碱基A或G，N为任意碱基。在本专利技术的一种实施方式中，所述移除cre位点的PamyQ’启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.7。在本专利技术的一种实施方式中，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因的上游引物序列为SEQIDNO.8，下游引物序列为SEQIDNO.9。在本专利技术的一种实施方式中，所述PamyQ’启动子的上游引物序列为SEQIDNO.10，下游引物序列为SEQIDNO.11。在本专利技术的一种实施方式中，所述P43启动子的上游引物序列为SEQIDNO.12，下游引物序列为SEQIDNO.13。在本专利技术的一种实施方式中，所述PgsiB启动子的上游引物序列为SEQIDNO.14，下游引物序列为SEQIDNO.15。在本专利技术的一种实施方式中，所述Popuaa启动子的上游引物序列为SEQIDNO.16，下游引物序列为SEQIDNO.17。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600。本专利技术提供了一种生产葡萄糖脱氢酶的方法，所述方法为使用上述一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将上述一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌现在种子培养基中进行培养，得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基进行培养，得到含葡萄糖脱氢酶的发酵培养液。本专利技术提供了上述一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌或上述一种生产葡萄糖脱氢酶的方法在生产葡萄糖脱氢酶、制备葡萄糖传感器、制备葡萄糖检测试剂盒以及检测葡萄糖方面的应用。有益效果：(1)本专利技术以以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因作为目的基因，以pMA5质粒或插入了PamyQ’启动子的pMA5质粒或插入了P43启动子的pMA5质本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD‑GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
【技术特征摘要】
1.一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。2.如权利要求1所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了PamyQ’启动子的pMA5质粒或插入了P43启动子的pMA5质粒或插入了PgsiB启动子的pMA5质粒或插入了Popuaa启动子的pMA5质粒或插入了移除cre位点的PamyQ’启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；所述cre位点是指启动子上游的一段具有回文结构的保守序列。3.如权利要求1或2所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述启动子的插入位点在pMA5质粒自带的PHpaⅡ启动子的下游。4.如权利要求1-3任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因来源于洋葱伯...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玲，杨海麟，林荣，王男，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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