乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛‑3‑磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD

Recombinant Bacillus subtilis with increased production of acetylglucosamine

The present invention relates to a recombinant Bacillus subtilis, which integrates and expresses pyruvate carboxylase BalpycA, glyceraldehyde 3 108

【技术实现步骤摘要】
乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
本专利技术涉及遗传工程领域，尤其涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌。
技术介绍
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(GenerallyRegardedasSafe)安全级别。枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖反应式为：5/2葡萄糖+ATP+5NAD++2NH3→N-乙酰氨基葡糖+谷氨酸盐+ADP+5NADH+2CO2+磷酸盐。该方程是通过计算从头合成乙酰氨基葡萄糖的3个前体六磷酸果糖、乙酰辅酶A和谷氨酰胺得到，从方程中可以看出在乙酰氨基葡萄糖合成的过程中伴随着大量的NADH的产生。过量生成的NADH对N-乙酰氨基葡萄糖生产途径最大理论得率(Yc)产生巨大的消极影响。因为细胞要维持还原力平衡，过量产生的NADH将通过两种方式消耗，一方面参与其他代谢的合成(导致副产物的产生)，另一方面被氧化产生ATP(导致发酵过程需要消耗大量O2，同时也会造成菌体量大量生成)。此外，利用枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖时会伴随着代谢溢流，导致副产物乙偶姻的大量合成。因此，如何有效处理伴随乙酰氨基葡萄糖生成的NADH及乙酰氨基葡萄糖合成效率，同时避免中心碳代谢溢流，提碳原子经济性，是微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖产量过程中亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，本专利技术的重组枯草芽孢杆菌消除了枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流、平衡胞内还原力，乙酰氨基葡萄糖发酵产量大大提高。在一方面，本专利技术提供了一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。进一步地，重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGNKAP2作为出发菌株，枯草芽孢杆菌BSGNKAP2如专利申请号为CN201610517961.9的中国专利所公开的。进一步地，丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh分别使用强组成型启动子表达。进一步地，强组成型启动子为可使用于枯草芽孢杆菌的启动子，如P43、PabrB、PvalS、Phag、PspoVG、PyvyD、PhemA或Pffh启动子。优选地，强组成型启动子为P43启动子进一步地，丙酮酸羧化酶BalpycA的编码基因balpycA如NCBI-ProteinID:AAS42897所示；丙酮酸羧化酶BalpycA整合至枯草芽孢杆菌基因组malS、pyk、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，丙酮酸羧化酶BalpycA整合至枯草芽孢杆菌基因组malS位点。进一步地，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor的编码基因如NCBI-ProteinID:CAF30501所示；甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor整合至枯草芽孢杆菌基因组pyk、malS、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor整合至枯草芽孢杆菌基因组pyk位点。进一步地，异柠檬酸NAD+脱氢酶icd的编码基因如NCBI-ProteinID:AKC61181所示；异柠檬酸NAD+脱氢酶icd整合至枯草芽孢杆菌基因组ywkA、pyk、malS、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，异柠檬酸NAD+脱氢酶icd整合至枯草芽孢杆菌基因组ywkA位点。进一步地，苹果酸醌脱氢酶mqo的编码基因如NCBI-ProteinID:ADK05552所示；苹果酸醌脱氢酶mqo整合至枯草芽孢杆菌基因组kdgA、pyk、ywkA、malS、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，苹果酸醌脱氢酶mqo整合至枯草芽孢杆菌基因组kdgA位点。进一步地，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB的编码基因如NCBI-ProteinID:ADK06337和NCBI-ProteinID:ADK06336所示；丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB整合至枯草芽孢杆菌基因组melA、pyk、ywkA、kdgA、malS、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB整合至枯草芽孢杆菌基因组melA位点。进一步地，固氮酶铁蛋白cyh的编码基因如NCBI-ProteinID:ACV00712所示；固氮酶铁蛋白cyh整合至枯草芽孢杆菌基因组pckA、pyk、ywkA、kdgA、melA、malS、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，固氮酶铁蛋白cyh整合至枯草芽孢杆菌基因组pckA位点。进一步地，丙酮酸羧化酶BalpycA来源于蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的丙酮酸羧化酶PycA。外源引入来源于蜡样芽孢杆菌等菌株的丙酮酸羧化酶BalpycA，可消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成。进一步地，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor来源于甲烷球菌MethanococcusmaripaludisKA1，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶。进一步地，异柠檬酸NAD+脱氢酶icd来源于生孢梭菌Clostridiumsporogenes，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的异柠檬酸NAD+脱氢酶。进一步地，苹果酸醌脱氢酶mqo来源于蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的苹果酸醌脱氢酶。进一步地，丙酮酸铁氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛‑3‑磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。

【技术特征摘要】
1.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGNKAP2作为出发菌株。3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh分别使用强组成型启动子表达。4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述强组成型启动子为P43、PabrB、PvalS、Phag、PspoVG、PyvyD、PhemA或Pffh启动子。5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述丙酮酸羧化酶BalpycA的编码基因balpycA如NCBI-ProteinID:AAS42897所示；所述丙酮酸羧化酶BalpycA整合至枯草芽孢杆菌基因组malS、pyk、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。6.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor的编码基因如NCBI-ProteinID:CAF30501所示；所述甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor整合至枯草芽孢杆菌基因组pyk、malS、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。7.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，顾洋，邓洁莹，陈坚，堵国成，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32