一种非达霉素基因工程菌及构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种高产非达霉素的基因工程菌德干高原游动放线菌YP‑2(Actinoplanes deccanensis YP‑2)及构建方法，通过将非达霉素生物合成正调控基因导入出发菌德干高原游动放线菌YP‑1中，筛选得到高产非达霉素的基因工程菌德干高原游动放线菌YP‑2，产量比出发菌提高了400％～500％，高达130mg/L，具有很好的应用前景。本发明专利技术方法高效、准确、操作方便，为放线菌药物高效生物合成途径的构建提供了一种新的研究手段。所述的非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP‑2可在制备治疗艰难梭菌感染引起的腹泻药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
一种非达霉素基因工程菌及构建方法和应用
本专利技术属于微生物制药领域，涉及一种高产非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)及其构建方法与应用。
技术介绍
临床上抗生素的大量使用，导致病原菌产生耐药性，更为严重的是细菌还能有效扩散耐药性基因信息，多种类别抗生素耐药的病原菌比例不断增加，对临床治疗产生了较大负面影响。艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI)是由一种革兰氏阳性芽孢杆菌难辨梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile)过度生长并释放毒素引起的，可导致结肠炎症、严重腹泻甚至死亡。以往资料显示，CDI主要影响老年人、长期住院和重症监护室的患者，近年来健康人群及儿童感染的病例报道逐渐增多。治疗CDI的首选药物是万古霉素和甲硝唑，但随着耐药菌株逐渐出现，寻找更加有效的治疗药物成为近年来的主要研究目标。非达霉素(fidaxomicin)，又称为台勾霉素(Tiacumicin又称LipiarmycinA3，OPT-80，PAR-101)，是一种可口服给药的新型大环内酯类抗生素，原研厂Optimer公司于2011年5月获FDA批准上市，但中国至今未有该药品获CFDA批准上市。临床研究表明：与口服万古霉素相比，非达霉素的疗效优于万古霉素，用药后对艰难梭菌有很强的抑制作用，并能有效降低艰难梭菌感染的复发率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种非达霉素工程菌德干高原游动放线菌YP-2，分类命名为：ActinoplanesdeccanensisYP-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCCNo.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的另一个目的是提供所述非达霉素工程菌德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)的构建方法，包括将非达霉素生物合成正调控基因导入出发菌，筛选得到高产非达霉素的德干高原游动放线菌基因工程菌株(ActinoplanesdeccanensisYP-2)。本专利技术构建方法具体步骤如下：(1)设计特异性引物扩增SEQIDNO.1序列并回收，上游引物SEQIDNO.3：aagatctgcccagcatatgaactgttgaaagttgttta下游引物SEQIDNO.4：ccaagatctgcccagcatatgtcaggcggaatccgccatg；(2)步骤1中回收的片段酶切插入表达载体pIJ8630上得到质粒pIJ8630-ermE*-fadR1，并验证；(3)步骤2中获得的质粒通过化转导入大肠杆菌E.coilET12567/pUZ8002中；(4)通过双亲本接合转导将步骤2中的质粒转入出发菌德干高原游动放线菌(Actinoplanesdeccanensis)YP-1中；德干高原游动放线菌YP-1购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏号为：CGMCCNo.4.2098，分类命名：德干高原游动放线菌(Actinoplanesdeccanensis)，保藏日期：2001年8月16日；(5)通过发酵获筛选得到高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)，产量高达130mg/L，比出发菌高400％～500％，所述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：ActinoplanesdeccanensisYP-2，保藏号：CGMCCNo.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述方法中，步骤2-4将SEQIDNO.1的序列插入质粒pIJ8630导入到出发菌德干高原游动放线菌YP-1。其中，步骤1中SEQIDNO.1由3063个核苷酸组成，第1-19位为NdeI识别位点和保护碱基，第20-297位为红霉素抗性基因启动子，第297-3042为非达霉素生物合成正调控基因的编码序列，第3043-3063位为NdeI识别位点和保护碱基，SEQIDNO.2为非达霉素生物合成正调控基因的氨基酸序列。上述方法中，步骤2将所述的SEQIDNO.1序列片段经过NdeI酶切后插入表达载体上pIJ8630上，启动子为含红霉素抗性基因启动子；步骤3-4将表达载体利用大肠杆菌进行双亲接合获得所述的高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)。上述方法中，步骤4所述作为出发菌为德干高原游动放线菌(Actinoplanesdeccanensis)YP-1，步骤3所述大肠杆菌为E.coilET12567(pUZ8002)。上述方法中，经筛选得到的高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)产量比出发出发菌高400％～500％，高达130mg/L。本专利技术的再一个目的是提供所述非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)在制备治疗艰难梭菌感染引起的腹泻药物中的应用。本专利技术人从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)购买了一株产非达霉素的出发菌游动放线菌，但该菌株产非达霉素低，不适合工业应用。本专利技术所述的高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)，经过发酵可大量生产治疗艰难梭菌感染引起腹泻的药物非达霉素，其产量比出发菌提高了400％～500％，高达130mg/L，具有很好的应用前景，可推进非达霉素产业化开发。本专利技术的优点是：(1)本专利技术通过体内过表达非达霉素生物合成正调控基因，获得了高产非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)，不需进行体外表达，从而克服了有些蛋白在体外难以表达，表达后无活性或活性较低等问题，操作快捷方便；不需准备体外反应底物，避免了有些底物难以制备或购买的问题；不需摸索体外反应条件，简化流程。(2)本专利技术所构建的高产非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)产量比出发菌提高了400％～500％，高达130mg/L，大大降低了非达霉素的生成成本，为工业生产提高非达霉素发酵产量提供技术支持。本专利技术通过体内基因工程改造，理性优化非达霉素的生物合成，获得了高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)，该方法高效、准确、操作方便，为放线菌药物高效生物合成途径的构建提供了一种新的研究手段。所述的非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(ActinoplanesdeccanensisYP-2)可在制备治疗艰难梭菌感染引起的腹泻药物中的应用。附图说明图1是高表达质粒构建图。图2是德干高原游动放线菌YP-1和德干高原游动放线菌YP-2在发酵过程中生物量曲线。图3是德干高原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌，分类命名为：德干高原游动放线菌YP‑2（Actinoplanes deccanensis YP‑2），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一种非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌，分类命名为：德干高原游动放线菌YP-2（ActinoplanesdeccanensisYP-2），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种构建高产非达霉素基因工程菌的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将非达霉素生物合成的正调控基因导入出发菌德干高原游动放线菌YP-1中，筛选得到非达霉素产量高于出发菌的基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2（ActinoplanesdeccanensisYP-2）；德干高原游动放线菌YP-1购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCCNo.4.2098，分类命名：德干高原游动放线菌（Actinoplanesdeccanensis），保藏日期：2001年8月16日。3.根据权利要求2所述的构建高产非达霉素基因工程菌的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）设计特异性引物扩增SEQIDNO.1序列并回收；上游引物SEQIDNO.3：aagatctgcccagcatatgaactgttgaaagttgttta下游引物SEQIDNO.4：ccaagatctgcccagcatatgtcaggcggaatccgccatg（2）步骤（1）中回收的片段酶切插入表达载体pIJ8630上得到质粒pIJ8630-ermE*-fadR1，并验证；（3）步骤（2）中获得的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永泉，毛旭明，郦月萍，俞品，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33