一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌制造技术

本发明专利技术公开了一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程技术领域。本发明专利技术工程菌实现了放线菌来源的内源性磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的高效表达，其生产得到的磷脂酶D活性可达25U/mL，在医药、食品、保健品领域具有很大的应用价值；同时，其采用的磷脂酶D是放线菌来源的内源性磷脂酶D，具有高反应活性、高转磷脂酰底物选择性以及高有机介质稳定性，且催化结构最紧密，更适用于工业化生产中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌
本专利技术涉及一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程

技术介绍
磷脂酶D属于磷脂酰二酯合成酶类，具有该家族的明显特征，即含有两个间隔出现的H(x)K(x)4D(H代表组氨酸；K代表赖氨酸；D代表天冬氨酸；X代表任意氨基酸)保守序列。它可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，是合成磷酯酰丝氨酸，磷脂酰肌醇等稀有磷脂的良好工具酶一。利用磷脂酶D具有高度专一性的特点，对现有来源广泛的粗品磷脂进行转化和改性，可以制备一些稀有磷脂，在医药及食品保健品领域具有很大的应用价值。目前，磷脂酶D主要通过从大豆等植物或动物脑中分离提取得到，生产成本高，环境污染代价大，售价昂贵，不能满足市场需求；现有的一些通过生物发酵大量获得真核来源的尝试，结果都不理想，这些真核在发酵生产时，要么生成的酶活性低，要么生成的酶呈现与膜结合的状态。因此，急需找到一种可大量制备磷脂酶D的方法。放线菌来源的内源性磷脂酶D和植物以及真菌来源的磷脂酶D相比，除具有较高的反应活性外，更兼具转磷脂酰底物选择性高，催化结构最紧密以及在有机介质稳定性高等方面的优势，更适合应用于工业中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。目前，该来源的磷脂酶D在大肠杆菌，毕赤酵母，解脂耶氏酵母，链霉菌中表达均有报道。有研究表明在大肠杆菌中磷脂酶D蛋白易形成包涵体，且磷脂酶D对大肠杆菌的生长有抑制作用，导致分泌量很低；而酵母为真核生物，发酵周期通常较长，且在酵母中磷脂酶D的酶活和蛋白表达量均不显著，并不适用于工业化生产；虽然链霉菌的克隆表达系统已经比较成熟，但相比于原核表达系统，外源基因的引入相对复杂，部分链霉菌还存在一定的限制修饰系统，导致转化率过低，且链霉菌生长过程较为复杂且易发生遗传突变，成熟的表达系统数量也有限，以上瓶颈限制了链霉菌表达系统的广泛应用。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别，且具有清晰的生理和遗传背景，我们尝试以枯草芽孢杆菌为表达宿主来表达磷脂酶D并运用基因工程手段构建一种适用于工业生产的能大量生产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌。但是，链霉菌属于放线菌目的一科，枯草芽孢杆菌则属于芽孢杆菌属的一种，两者属于不同的菌种，遗传上可能存在一些隔阂，导致链霉菌来源的目的基因可能并不能被枯草所识别。因此，在枯草芽孢杆菌中表达磷脂酶D存在一定的难点；如何基因工程手段提高磷脂酶D的表达量也仍需进一步的研究。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，实现了放线菌来源的内源性磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的高效表达。本专利技术工程菌生产得到的磷脂酶D活性可达25U/mL，在医药、食品、保健品领域具有很大的应用价值；同时，本专利技术工程菌采用的磷脂酶D是放线菌来源的内源性磷脂酶D，其具有高反应活性、高转磷脂酰底物选择性以及高有机介质稳定性，且催化结构最紧密，更适用于工业化生产中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒；所述重组质粒包含融合基因以及表达载体；所述融合基因为磷脂酶D基因(PLD)与枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽基因(amyE)融合后的PLD-amyE；所述表达载体为pMA0911。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D基因来源于链霉菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽基因来源于枯草芽孢杆菌WB168。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽的核苷酸序列为SEQIDNO.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌宿主菌株为枯草芽孢杆菌WB600菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒为RBS及spacer区进行过优化的重组质粒；所述优化是指将重组质粒的RBS及spacer区替换为翻译速率提升的RBS及spacer区；所述翻译速率是指RBS及spacer区的mRNA翻译成蛋白质的速率。在本专利技术的一种实施方式中，所述优化为将重组质粒pMA0911-PLD-amyE的RBS及spacer区替换为较原始RBS及spacer区翻译速率提高3倍的RBS及spacer区。在本专利技术的一种实施方式中，所述优化为将重组质粒pMA0911-PLD-amyE的RBS及spacer区通过PCR进行全质粒扩增替换为较原始RBS及spacer区翻译速率提高3倍的RBS及spacer区。在本专利技术的一种实施方式中，所述优化后的RBS及spacer区的核苷酸序列为SEQIDNO.3。本专利技术提供了上述高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌制备得到的磷脂酶D。本专利技术提供了上述高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌或上述制备得到的磷脂酶D在制备磷脂以及磷脂衍生物方面的应用。本专利技术提供了一种高效表达磷脂酶D的方法，此方法为使用上述枯草芽孢杆菌工程菌为生产菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为先将重组枯草芽孢杆菌接种于接种于种子培养基中，于35～37℃、180～200rpm下培养至对数生长期，作为种子液，再将种子液接入到发酵培养基中，于35～37℃、180～200rpm条件下培养36h。在本专利技术的一种实施方式中，所述将种子液接入发酵培养基的接种量为3％。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子培养基含有胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子培养基中含有50μg/mL的卡那抗生素。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基含有甘油15g/L，胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，三水磷酸氢二钾16.42g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基中含有50μg/mL的卡那抗生素。本专利技术提供了上述高效表达磷脂酶D的方法制备得到的磷脂酶D。本专利技术提供了上述高效表达磷脂酶D的方法或上述制备得到的磷脂酶D在制备磷脂以及磷脂衍生物方面的应用。有益效果：(1)本专利技术工程菌成功实现了链霉菌来源的磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的胞外异源分泌表达；(2)本专利技术工程菌生产得到的磷脂酶D活性可达25U/mL，在医药、食品、保健品领域具有很大的应用价值；(3)本专利技术工程菌采用的磷脂酶D是放线菌来源的内源性磷脂酶D，其具有高反应活性、高转磷脂酰底物选择性以及高有机介质稳定性，且催化结构最紧密，更适用于工业化生产中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成；(4)使用本专利技术工程菌生产磷脂酶D能够避免酶形成包涵体，有一定应用前景；(5)磷脂酶D是一类重要的跨膜信号转导酶类，其能通过磷酰基转移作用催化磷脂质的极性头部基团的转移，而PLD的磷酰基转移作用非常重要，它可以将磷脂酰胆碱(PC)催化合成磷脂酰乙醇胺(PE)、磷酯酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)等在自然界稀有的磷脂质，这些稀有磷脂质在食品、化妆品、药品中十分重要，尤其是磷酯酰丝氨酸，其只占总磷脂含量的2％-10％左右，但保健功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒与枯草芽孢杆菌表达宿主；所述重组质粒包含融合基因以及表达载体；所述融合基因为磷脂酶D基因(PLD)与枯草芽孢杆菌ɑ‑淀粉酶信号肽基因(amyE)融合后的PLD‑amyE；所述表达载体为pMA0911。

【技术特征摘要】
1.一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒与枯草芽孢杆菌表达宿主；所述重组质粒包含融合基因以及表达载体；所述融合基因为磷脂酶D基因(PLD)与枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽基因(amyE)融合后的PLD-amyE；所述表达载体为pMA0911。2.如权利要求1所述的一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述磷脂酶D基因来源于链霉菌。3.如权利要求1或2所述的一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌ɑ-淀粉酶信号肽基因来源于枯草芽孢杆菌WB168。4.如权利要求1-3任一所述的一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述重组质粒为RBS及spacer区进行过优化的重组质粒；所述优化是指将重组质粒的RBS及spacer区替换为翻译速率提升的RBS及spacer区；所述翻译速率是指RBS及spacer区的mRNA翻译成蛋白质的速率。5.如权利要求2-4任一所述的一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述优化为将重组质粒pMA0911-PLD-amyE的RBS及space...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，金峰，李江波，黄婷婷，李江华，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32