阿维菌素生产菌株及提高阿维菌素产量的方法技术

本发明专利技术公开了阿维菌素生产菌株及提高阿维菌素产量的方法，所述阿维菌素生产菌株为失活或减弱表达了SAV3804基因的菌株。通过将构建的阿维链霉菌SAV3804基因缺失载体引入到阿维链霉菌中，经同源双交换获得缺失SAV3804基因的工程菌。分别在阿维链霉菌野生型和阿维菌素高产菌株中缺失SAV3804基因，其阿维菌素产量较出发菌相比均显著提高。本发明专利技术提供的遗传改造策略为提高阿维菌素产量提供新方法，从而在实践上可以用于阿维菌素的发酵生产。

【技术实现步骤摘要】
阿维菌素生产菌株及提高阿维菌素产量的方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及阿维菌素生产菌株及提高阿维菌素产量的方法
技术介绍
阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)发酵产生的一组结构相似的十六元环大环内酯类抗生素，具有高效、广谱、低毒的杀虫活性，其天然发酵产物包含8个组份：A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b，其中B1的杀虫活性最强，是商品化阿维菌素的组份，几乎抗所有与农业有关的线虫和节肢动物等害虫，被广泛应用于农业生产上。伊维菌素是阿维菌素B1在C-22,23位的双氢还原产物，它与阿维菌素杀虫活性相同，但毒性低2-3倍，使用更安全，更适用于人和动物体内外寄生虫的防治，被广泛应用于兽药和医药上。阿维菌素和伊维菌素的作用机制与一般杀虫剂不同，对哺乳动物的毒性很小，选择性极高。由于阿维菌素衍生物伊维菌素从根本上降低了盘尾丝虫症(河盲症)和淋巴丝虫病(象皮病)的发病率，阿维菌素的发现者Omura和Campbell获得了2015年诺贝尔生理学或医学奖。阿维菌素对常用农药产生耐药和抗药性的害虫具有良好的功效，而相对于化学农药，它的使用量较少而且效用时间长，同时在植物和土壤的表面可在日光下迅速分解，因此对人、畜和生态环境有较高的安全性。被业内人士称为“青春永驻”的阿维菌素，自上世纪80年代由Merk公司投放市场以来，几十年宝刀不老，目前已是全球用量最大，使用技术最成熟的绿色生物农药。国内经“七五”至“九五”的连续攻关，使阿维菌素实现了产业化，截至2015年9月，中国成为阿维菌素唯一生产国。阿维菌素是仅有的一个年产值达到30亿元的生物农药，为我国带来了巨大的经济和社会效益。但如何进一步提高阿维菌素产量，降低生产成本，提升我国阿维菌素的产业化水平，是阿维菌素研究中一个永恒的主题。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素的产量，具有重要的意义和实际应用价值。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供阿维菌素的生产菌株及提高阿维菌素产量的方法。本专利技术提供一种阿维菌素生产菌株，所述生产菌株中SAV3804基因失活或减弱表达。本领域技术人员应当理解，SAV3804基因失活可以通过在SAV3804基因中缺失、插入或替换一个或多个碱基实现，使得SAV3804基因丧失功能。优选地，所述失活为通过将SAV3804基因部分或全部缺失；所述减弱表达为通过将SAV3804基因的转录或表达调控元件替换为具有较低活性的元件。所述生产菌株可以是任何能够产生阿维菌素的链霉菌属细菌，优选为阿维链霉菌。所述生产菌株的出发菌株可以是任何能够产生阿维菌素的链霉菌属细菌，优选为阿维链霉菌。本领域技术人员应当理解，能够产生阿维菌素的菌株可以是阿维链霉菌野生型菌株，或者经诱变和/或基因工程改造后能够产生阿维菌素的菌株。在本申请的具体实施方式中，采用的出发菌株为阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267，和经常规诱变获得的阿维菌素高产菌株76-02-e(李丽莉,郭佳,文莹,等.过表达核糖体循环因子提高阿维链霉菌菌株中的阿维菌素产量.工业微生物生物技术杂志,2010,37:673–679)。所述SAV3804基因具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。本专利技术还提供一种制备所述生产菌株的方法，包括如下步骤：构建SAV3804基因的遗传修饰载体，并将所述载体引入产阿维菌素的菌株中获得SAV3804基因失活或减弱表达的菌株。具体地，所述遗传修饰载体的出发载体可以为任意一种含有链霉菌温度敏感型复制子的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。优选为pKC1139、pGM160、pHZ132或pCZA185等。在本专利技术提供的具体实施方式中，以pKC1139为出发载体构建了SAV3804基因缺失载体pD3804。所述将载体引入产阿维菌素的菌株中，可以采用微生物基因工程领域中常用的方法，例如PEG介导的原生质体转化法、电转化法、接合转移法等，优选PEG介导的原生质体转化法。为提高转化效率，可以先将遗传修饰载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌中，从中提取质粒再转化到产阿维菌素的菌株中。本专利技术通过失活或减弱表达SAV3804基因，构建的阿维菌素生产菌株，其阿维菌素产量显著提高，证明SAV3804基因能够用于提高阿维菌素的产量。因此，本专利技术还提供了SAV3804基因在提高阿维菌素产量中的应用。具体地，所述应用为通过将SAV3804基因失活或减弱表达，所述应用为在链霉菌属细菌中，优选地，为在阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)中。进一步地，本专利技术还提供一种提高阿维菌素产量的方法以及生产阿维菌素的方法，通过发酵具有失活或减弱表达的SAV3804基因的生产菌株实现。本专利技术的有益效果在于：通过控制SAV3804基因的表达水平，构建阿维菌素生产菌株。将阿维链霉菌野生型菌株中的SAV3804基因缺失，其阿维菌素发酵产量提高了4.4～4.6倍；将阿维菌素高产菌76-02-e中的SAV3804基因缺失，其阿维菌素产量提高了23.5～27％，因此，本专利技术提供的通过失活或减弱表达SAV3804基因的改造策略，可以显著提高阿维菌素的产量，降低阿维菌素的生产成本，可以在实践中用于阿维菌素的发酵生产。附图说明图1为SAV3804基因缺失载体pD3804的质粒图谱。图2为SAV3804基因缺失载体pD3804与阿维链霉菌染色体的同源双交换示意图。图3为阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其SAV3804缺失突变株的阿维菌素发酵单位。图4为阿维菌素高产菌株76-02-e及其SAV3804缺失突变株的阿维菌素发酵单位。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1SAV3804基因缺失载体的构建为寻找影响阿维菌素产量的关键因子，我们对野生型菌株ATCC31267和阿维菌素高产菌株的转录组进行分析，发现SAV3804基因在高产菌株中的表达显著下调，暗示该基因产物负调控阿维菌素的生物合成。一、阿维链霉菌SAV3804基因上、下臂的克隆阿维链霉菌基因组中的SAV3804基因编码一个含有980个氨基酸(SEQIDNO.2)的SARP家族转录调控因子。根据Genbank公布的阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267中SAV3804基因[NC_003155.4(4704929..4707871)]的序列及其上、下游的序列设计PCR引物：PrimerLWS60：5′-GGAATTCTGCCGCCCAGGAAGGTCA-3′,EcoRIPrimerLWS61：5′-CCGTTCAGGGACTTGCCGCGCTTTCTCCCCGTGCCA-3′PrimerLWS62：5′-TGGCACGGGGAGAAAGCGCGGCAAGTCCCTGAACGG-3′Pr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.阿维菌素生产菌株，其特征在于，其中SAV3804基因失活或减弱表达。

【技术特征摘要】
1.阿维菌素生产菌株，其特征在于，其中SAV3804基因失活或减弱表达。2.根据权利要求1所述的阿维菌素生产菌株，其特征在于，所述失活为通过将SAV3804基因部分或全部缺失；所述减弱表达为通过将SAV3804基因的转录或表达调控元件替换为具有较低活性的元件。3.根据权利要求1或2所述的阿维菌素生产菌株，其特征在于，所述阿维菌素生产菌株为链霉菌属细菌，优选为阿维链霉菌。4.根据权利要求1～3任意一项所述的阿维菌素生产菌株，其特征在于，所述SAV3804基因具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。5.一种制备权利要求1～4任意一项所述的阿维菌素生产菌株的方法，其包括如下步骤：构建SA...

【专利技术属性】
技术研发人员：文莹，刘文帅，陈芝，李季伦，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11