一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，特别是指一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法及其应用。通过将负责枯草芽孢杆菌错配修复系统的操纵子MutSL置于木糖诱导启动子及阻遏蛋白调控之下，并构建相应诱导表达的重组质粒，利用Spizizen双交换将重组质粒整合至菌株基因组，并经过正负筛选获得目的工程菌株，通过不同木糖添加浓度调节错配修复系统操纵子MutSL不同表达水平，进而实现人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率。

A GENETIC OPERATION METHOD FOR ARTIFICIAL CONTROL OF SPONTANEOUS MUTATION RATE OF Bacillus subtilis AND ITS APPLICATION

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a genetic operation method for artificially controlling the spontaneous mutation rate of Bacillus subtilis and its application. MutSL, the operator responsible for the mismatch repair system of Bacillus subtilis, was placed under the control of xylose-inducible promoter and repressor protein, and the recombinant plasmid was constructed. The recombinant plasmid was integrated into the genome of Bacillus subtilis by Spizizen double exchange, and the target engineering strain was obtained through positive and negative screening. Sugar concentration regulates the expression level of MutSL, the operator of mismatch repair system, to control the spontaneous mutation rate of Bacillus subtilis artificially.

【技术实现步骤摘要】
一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法及其应用
本专利技术属于生物
，特别是指一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法及其应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种，无致病性，对人畜无害，不污染环境，具有较强的抗逆能力和抗菌防病作用，被广泛用为分子生物学研究模式生物以及工业化生产高产菌株宿主。近年來，随着第二代和第三代高通量测序技术的广泛应用，适应性实验室进化等研究日益成为研究热点。适应性实验室进化是在实验室条件下，人工模拟自然进化中的变异和选择过程，借助于人工选择压力实现生物的定向进化，并从进化群体中筛选出优良性状个体的一种方法，目前已经应用于提升菌株对底物（或产物）耐受性、底物利用速率以及菌株生长速率等方面。对于适应性实验室进化来说，基因突变是其进化的主要动力，但是在进化过程中，微生物为保持自身基因组的完整性，胞内存在严格的错配修复机制，用来消除复制和重组事件中产生的错配区域，进而降低了细胞的自然突变率（<10-6），导致进化周期长。而错配修复机制是细胞在复制后的一种修复机制，存在的DNA错配修复系统可维持DNA复制的高保真度，抑制基因突变。本专利技术通过将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的错配修复机制（由基因组上MutSL操纵子负责完成功能）置于来源于质粒pAX01的木糖诱导启动子及阻遏蛋白控制，构建受木糖添加浓度控制操纵子MutSL的不同表达水平，进而获得工程菌株不同突变率水平，为适应性实验室进化提供优秀出发菌株，缩短进化周期。
技术实现思路
本专利技术提出一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法及其应用，降低了维持细胞内严格错配修复机制相应的操纵子的表达水平，进而达到人工控制细胞的突变率的目的。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法，步骤为：将枯草芽孢杆菌的错配修复系统MutSL置于来源于质粒pAX01的木糖诱导启动子及阻遏蛋白控制下，构建受木糖添加浓度诱导表达的操纵子MutSL的不同表达水平的重组质粒，然后利用Spizizen双交换整合至菌株内，经筛选获得目的工程菌株，进而实现人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率。所述的人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率在制备高突变率的枯草芽孢杆菌工程菌株的应用。包括以下步骤：（1）质粒pAX01-mutS的构建；（2）质粒pSS-mutS的构建；（3）质粒pSS-mutSL的构建；（4）将质粒pSS-mutSL利用Spizizen双交换整合至菌株B.subtilis168Δupp基因组，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子；（5）将步骤（4）中发生双交换基因重组的阳性转化子接种于LB液体培养基上，通过发生分子内同源重组删除两DR区（Directrepeat，直接重复序列）之间所有的筛选标记的细胞，然后将发生过分子内同源重组的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出阳性菌株B.subtilisMutSL，即为高突变率的枯草芽孢杆菌工程菌株。所述质粒pAX01-mutS含有木糖启动子PxylA和编码XylR阻遏蛋白的xylR基因。所述步骤（1）质粒pAX01-mutS构建的具体步骤为：以B.subtilis168基因组为模板，以上游引物pAX01-mutS-F序列如SEQIDNO：1所示和下游引物pAX01-mutS-B序列如SEQIDNO：2所示为引物，获得包含有下游同源区mutS-B的目的基因片段，将目的基因片段与pAX01质粒经酶切、连接、转化、验证后，得到质粒pAX01-mutS。所述质粒pSS-mutS含有操纵子MutSL的上游同源区mutS-F。所述步骤（2）质粒pSS-mutS构建的具体步骤为：以B.subtilis168基因组为模板，使用上游引物pSS-mutS-F序列如SEQIDNO：3所示和下游引物pSS-mutS-B序列如SEQIDNO：4所示，将含有操纵子MutSL上游同源区mutS-F的目的片段与质粒pSS经酶切、酶连、转化、验证后，得到质粒pSS-mutS。所述质粒pSS-mutSL含有木糖启动子PxylA、编码XylR阻遏蛋白的xylR基因、操纵子MutSL的上游同源区mutS-F和下游同源区mutS-B。所述步骤（3）质粒pSS-mutSL构建的具体步骤为：以质粒pAX01-mutS为模板使用上游引物pSS-xylR-F序列如SEQIDNO：5所示和下游引物pSS-xylR-F序列如SEQIDNO：6所示，扩增含有木糖诱导启动子PxylA、阻遏蛋白XlyR的编码基因xlyR和操纵子MutSL的下游同源区mutS-B的目的基因片段，将目的基因片段与质粒pSS-mutS经酶切、酶连、转化、验证后，得到质粒pSS-mutSL。本专利技术的有益效果在于：一、本专利技术的突变率测定实验说明了在不添加木糖诱导物时B.subtilisMutSL菌株与出发菌株相比突变率提高了58.4倍，而在木糖诱导物浓度分别为0.5%、1.0%时，菌株的相对突变率分别提高了27.1倍和4.2倍；二、本专利技术制备的B.subtilisMutSL菌株在不同木糖诱导浓度条件下，具有不同的自发突变率，通过在培养基中添加适量浓度的诱导物木糖，可将菌株达到在所期望的突变率水平。三、本专利技术通过重组质粒将枯草芽孢杆菌基因组上负责错配修复系统的操纵子基因mutSL置于木糖诱导启动子PxylA调控之下，通过添加不同的木糖浓度，调节操纵子基因mutSL的表达水平，并使菌株的错配修复机制维持在所期望的水平，并使菌株达到在所期望的突变率水平。附图说明图1质粒pSS的质粒图谱图2质粒pAX01-mutS的质粒图谱。图3质粒pSS-mutSL的质粒图谱。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一、原材料及使用方法本专利技术所用到的原始菌株B.subtilis168、质粒pAX01来源为BGSC（BacillusGeneticStockCenter，http://www.bgsc.org/）。本专利技术中所用到的枯草芽孢杆菌出发菌株B.subtilis168Δupp来源于B.subtilis168，基础操作质粒pSS（质粒图谱如图1所示）来源于pUC18，二者详细构建过程可参考Shi,T.,etal.(2013)."EstablishmentofamarkerlessmutationdeliverysysteminBacillussubtilisstimulatedbyadouble-strandbreakinthechromosome."PloSOne8(11):e81370。本专利技术所用到的所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买（http://www.thermoscientificbio.com/fermentas）。其他生化试剂从生工生物工程（上海）股份有限公司购本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法，其特征在于步骤为：将枯草芽孢杆菌负责错配修复系统的操纵子MutSL置于来源于质粒pAX01的木糖诱导启动子及阻遏蛋白调控之下，构建操纵子MutSL的表达受木糖诱导的重组质粒，利用Spizizen双交换整合至目的菌株基因组，并经过正负筛选获得目的工程菌株，进而实现人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率。

【技术特征摘要】
1.一种人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率的遗传操作方法，其特征在于步骤为：将枯草芽孢杆菌负责错配修复系统的操纵子MutSL置于来源于质粒pAX01的木糖诱导启动子及阻遏蛋白调控之下，构建操纵子MutSL的表达受木糖诱导的重组质粒，利用Spizizen双交换整合至目的菌株基因组，并经过正负筛选获得目的工程菌株，进而实现人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率。2.如权利要求1所述的人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率在制备高突变率的枯草芽孢杆菌工程菌株的应用。3.如权利要求2所述的人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率在制备高突变率的枯草芽孢杆菌工程菌株的应用，其特征在于包括以下步骤：（1）质粒pAX01-mutS的构建；（2）质粒pSS-mutS的构建；（3）质粒pSS-mutSL的构建；（4）将质粒pSS-mutSL利用Spizizen双交换整合至菌株B.subtilis168Δupp基因组，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子；（5）将步骤（4）中发生双交换基因重组的阳性转化子接种于LB液体培养基上，通过发生分子内同源重组删除两DR区之间所有的筛选标记的细胞，然后将删除了筛选标记的细胞涂布于5FU负筛选平板，筛选出目的阳性菌株B.subtilisMutSL，即为人工控制高突变率枯草芽孢杆菌工程菌株。4.如权利要求3所述的人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率重组质粒在制备高突变率的枯草芽孢杆菌工程菌株的应用，其特征在于：所述质粒pAX01-mutS含有木糖诱导启动子PxylA、编码XylR阻遏蛋白的xylR基因和操纵子MutSL的下游同源区mutS-B。5.如权利要求3所述的人工控制枯草芽孢杆菌自发突变率在制备高突变率的枯草芽孢杆菌工程菌株的应用，其特征在于，所述步骤（1）质粒pAX01-mutS构建的具体步骤为：以B.subtilis168基因组为模板，以上游引物pAX01-mutS-F序列如SEQIDNO：1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王光路，杨琳琳，张志平，王跃，张静涛，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南,41