本发明专利技术公开了一种表达红曲霉菌Mn‑SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，属于生物工程领域。本发明专利技术通过筛选并设计出红色红曲霉Mn‑SOD简并引物，利用PCR技术扩增红曲霉Mn‑SOD基因的全长序列，经EcoR I和HindIII酶切后连接至相同酶切的表达载体pET21a及pET28a，并分别转化至E.coli BL21，均实现合成酶基因在E.coli中的表达，得到具有酶活力和耐酸性的Mn‑SOD。本发明专利技术将红曲霉Mn‑SOD歧化酶基因导入到原核生物中实现表达，为红曲霉Mn‑SOD歧化酶的大规模生产、分离提供了可能，且本发明专利技术构建的工程菌分泌的MnSOD来源于红色红曲霉，在pH3.8条件下处理1h仍具有80%的活性，具有耐酸性，可用于耐酸性超氧化物歧化酶的生产菌株。
【技术实现步骤摘要】
一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法
本专利技术属于生物工程领域，具体地说涉及一种表达红色红曲霉菌（MonascusrubberCCTCCNO:M2013082）锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的工程大肠杆菌构建、表达方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，即SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化细胞体内的超氧阴离子自由基生成水和过氧化氢，消除超氧阴离子对细胞的危害。根据其结合金属离子的种类不同，超氧化物歧化酶分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种。Mn-SOD是由氨基酸残基构成的四面体，结构简单，主要存在于真核细胞的线粒体中。线粒体是真核生物细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体内过量产生超氧阴离子对线粒体乃致整个细胞造成伤害。因此，具有超氧阴离子自由基清除作用的Mn-SOD，是消除细胞线粒体内超氧阴离子、维持细胞的正常生长代谢的关键酶，对维持机体氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。目前已广泛地应用于医药、食品、化妆品等领域。红曲最早发现于中国，已有一千多年的生产应用历史，明代李时珍在《本草纲目》评价：“此乃人窥造化之巧者也”，“奇药也”。红曲霉菌是我国重要的微生物资源，在其生长代谢过程中能够产生多种具有生物活性的代谢产物，如具有超氧阴离子自由基清除作用的Mn-SOD。由于红曲菌产桔霉素问题的存在，国内外对红曲的安全性提出了怀疑。相关研究发现红曲霉中Mn-SOD序列可能与桔霉素的产生密切相关，在橙色红曲菌中得到了可能与桔霉素产毒相关的EST序列。经生物信息学分析，发现其中一个基因P5编码的蛋白与Mn-SOD高度同源（涂追.橙色红曲菌(AS3.4384)SOD基因的克隆与功能分析[D].南昌大学,2007.）。因此，研究红曲霉Mn-SOD序列及其表达对研究调控红曲霉桔霉素的产生具有重要意义。Mn-SOD是一种具有广阔前景的蛋白多肽类药物。在SOD家族中，Mn-SOD与其他SOD相比具有寿命长、分子量小、抗炎和抗辐射作用等优点，而且锰的毒性较铜、铁低。并且，红曲霉菌来源的Mn-SOD在酸性条件下具有一定的耐酸性。目前，尽管很多学者已从许多生物体克隆到了Mn-SOD基因，并且部分基因已经在原核或真核生物体内进行了表达，但国内对大肠杆菌表达Mn-SOD尤其是红曲霉来源Mn-SOD的研究还鲜见报道。因此，积极开展Mn-SOD基因工程技术有重大的研究意义。
技术实现思路
鉴于现有技术的上述不足，本专利技术的目的是一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建、表达方法，包括以下步骤：（1）查找NCBI数据库，进行Block对比，利用primerpremier5.0进行引物分析，筛选并设计出红曲霉菌（MonascusrubberCCTCCNO.M2013082）基因组Mn-SOD简并引物，简并引物序列分别见SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示。（2）从红曲霉菌（MonascusrubberCCTCCNO.M2013082）获得Mn-SOD基因的全长cDNA；再以总cDNA作为PCR为模板，在简并引物的引导下PCR扩增红曲霉菌（MonascusrubberCCTCCNO.M2013082）得到部分Mn-SOD基因；（3）通过红色红曲霉Mn-SOD基因组设计扩增引物，扩增得到完整红曲霉Mn-SOD基因组，用TD-PCR方法扩增Mn-SOD基因，得到产物重组至质粒pET39b，重组质粒命名为pET39b-SOD，并于大肠杆菌DH5α中克隆测序，确定正确的阳性克隆；以pET39b-SOD为模板，用PCR方法扩增Mn-SOD，经EcoRI和HindIII酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET21a上，构建成pET21a-MnSOD，并用相同的方法构建得到pET28a-MnSOD；所述扩增引物序列分别见SEQIDNO:3、SEQIDNO:4；（4）将pET21a-MnSOD、pET28a-MnSOD分别转移至大肠杆菌BL21中完成构建，并进行表达；所述的重组质粒表达载体导入大肠杆菌细胞，在IPTG诱导下表达得到有活性的Mn-SOD，并检测重组蛋白Mn-SOD活性。优选地，如上所述的一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株构建、表达方法，步骤（1）中所述的红曲霉菌为红色红曲霉（Monascusrubber），已于2013年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉武汉大学），其保藏编号为：CCTCCNO：M2013082。优选地，如上所述的一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建、表达方法，步骤（3）的红曲霉菌的Mn-SOD基因序列见SEQIDNO:5及推断的氨基酸序列见SEQIDNO:6。本专利技术的一种高效表达Mn-SOD的工程菌及其构建方法，与现有技术相比具有以下优点：（1）克隆得到了红色红曲霉完整的Mn-SOD基因序列，确保表达获得具有活力的Mn-SOD。（2）本专利技术构建的工程菌分泌的MnSOD来源于红色红曲霉，在pH3.8条件下处理1h仍具有80%的活性，具有耐酸性，可用于耐酸性超氧化物歧化酶的生产菌株；同时，利用基因工程技术生产Mn-SOD，能够解决工业上从动植物中直接分离提取SOD的原料限制问题，应用前景广阔。（3）本专利技术将红曲霉Mn-SOD歧化酶基因导入到原核生物中实现表达，为红曲霉Mn-SOD歧化酶的大规模生产、分离提供了可能。附图说明图1为PCR目的基因产物1%琼脂糖凝胶电泳图。图2为Mn-SOD的14%SDS-PAGE电泳图谱，其中40前——未诱导细胞以40mMWashBuffer清洗所得上清液，40后——诱导细胞以40mMWashBuffer清洗所得上清液，100前——未诱导细胞以100mMWashBuffer清洗所得上清液，100后——诱导细胞以100mMWashBuffer清洗所得上清液，150前——未诱导细胞以150mMWashBuffer清洗所得上清液，150后——诱导细胞以150mMWashBuffer清洗所得上清液，500前——未诱导细胞以500mMWashBuffer清洗所得上清液，500后——诱导细胞以500mMWashBuffer清洗所得上清液。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、设计与筛选红色红曲霉菌基因组Mn-SOD简并引物(1)查找Mn-SOD序列：从数据库NCBI中搜索SOD基因的氨基酸序列，选取了曲霉属(Aspergillus)中具有代表性的如下6个种的序列：红曲霉Aspergillusniger(GeneBank登录号：ABA71743.1)、烟曲霉Aspergillusfumigatus(GeneBank登录号：EAL90786.1)、米曲霉Aspergillusoryzae(GeneBank登录号：AAU04411.1)、白曲霉Aspergilluscandidus(GeneBank登录号：AAU04409.1)、黑曲霉Aspergillusphoenicis(GeneBank登录号：AAU04413.1)和黄曲霉Aspergillusflavus(GeneBa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达红曲霉菌Mn‑SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，其特征在于：该构建方法将红曲霉Mn‑SOD歧化酶基因导入到大肠杆菌中实现表达，具体包括如下步骤：（1）查找NCBI数据库，进行Block对比、引物分析，筛选并设计出红曲霉菌基因组Mn‑SOD的简并引物,所述简并引物序列分别见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2；（2）从红曲霉菌获得Mn‑SOD酶基因的全长cDNA，然后在简并引物的引导下PCR扩增红曲霉菌，得到部分Mn‑SOD基因；（3）通过红曲霉菌Mn‑SOD基因组设计扩增引物，扩增得到完整红曲霉菌Mn‑SOD基因组；用PCR方法扩增Mn‑SOD基因组，经EcoRI和Hind III酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET21a上，构建成pET21a‑SOD；用相同的方法构建pET28a‑MnSOD；所述扩增引物序列分别见SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；（4）将步骤（3）构建的重组质粒pET21a‑SOD、pET28a‑MnSOD表达载体分别导入大肠杆菌BL21细胞，并在IPTG诱导下表达得到有活性的Mn‑SOD，采用邻苯三酚自氧化法测定Mn‑SOD活性。...
【技术特征摘要】
1.一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，其特征在于：该构建方法将红曲霉Mn-SOD歧化酶基因导入到大肠杆菌中实现表达，具体包括如下步骤：（1）查找NCBI数据库，进行Block对比、引物分析，筛选并设计出红曲霉菌基因组Mn-SOD的简并引物,所述简并引物序列分别见SEQIDNO:1、SEQIDNO:2；（2）从红曲霉菌获得Mn-SOD酶基因的全长cDNA，然后在简并引物的引导下PCR扩增红曲霉菌，得到部分Mn-SOD基因；（3）通过红曲霉菌Mn-SOD基因组设计扩增引物，扩增得到完整红曲霉菌Mn-SOD基因组；用PCR方法扩增Mn-SOD基因组，经EcoRI和HindIII酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET21a上，构建成pET21a-SOD；用相同的方法构建pET28a-MnSOD；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟平，岳硕豪，何雨峰，秦松，宫春杰，黄莹琪，张华山，邓颖，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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