本发明专利技术公开了一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法，它是在现有苏云金芽胞杆菌毒素蛋白含量测定方法的基础上，通过采用特殊的样品预处理方法，解决了试样中杂质干扰毒素蛋白定量检测的问题，同时对SDS–PAGE凝胶配方进行了优化，进一步改善了凝胶电泳图谱中两种蛋白带的迁移率、分辨率和蛋白带形态，使测得的结果更加准确。本发明专利技术能用于Bti类产品的质量控制，具有操作简单易行、快速、成本低、受外界环境影响小等优点。
A Quantitative Detection Method for Toxin Protein of Bacillus thuringiensis Israelis Subspecies
The invention discloses a quantitative detection method for Bacillus thuringiensis Israelis subspecies toxin protein. Based on the existing determination method for Bacillus thuringiensis toxin protein content, the problem of impurities interfering with the quantitative detection of toxin protein in samples is solved by adopting special sample pretreatment method, and SD is also applied. The S \u2013 PAGE gel formula was optimized to further improve the mobility, resolution and protein band morphology of the two protein bands in the gel electrophoresis pattern, making the results more accurate. The invention can be used for quality control of Bti products, and has the advantages of simple operation, fast operation, low cost and little environmental impact.
【技术实现步骤摘要】
一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法
本专利技术属于毒素蛋白的定量检测领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)，是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴孢晶体，苏云金芽胞杆菌以色列亚种(Bacillusthuringrensissubsp.Israelensis，简称Bti)是Goldberg和Margalit于1977年发现的一种对蚊科幼龄害虫具有高度毒力的病原细菌，主要有效成份也是伴孢晶体，由多种毒素蛋白组成，其中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白是主要成分。Bt类产品的质量检测与控制，目前最有效的方法是生物测定，但因生物测定受靶标昆虫质量、数量及外界条件等影响，检测误差高达40％。Bt类产品的毒素蛋白含量测定在我国国标与化工行业标准中均采用SDS-PAGE凝胶电泳方法，如HG3617-1999的化工行业标准中报道的苏云金杆菌可湿性粉剂的毒素蛋白含量测定方法，用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其它杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。该方法能测出苏云金芽胞杆菌中分子量为130KD的毒素蛋白含量，但目前还没有同时测出苏云金芽胞杆菌以色列亚种中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白含量的方法报导。申请人曾尝试参照Bt可湿性粉剂标准HG3617-1999中毒素蛋白的检测方法来检测Bti中晶体蛋白含量，结果发现随着Bti试样取样量的增加，Bti毒素蛋白含量越来越低，甚至不出现晶体蛋白条带，说明用现有的Bt毒素蛋白的检测方法无法准确定量Bti毒素蛋白，因此迫切需要建立一种准确度高、受外界影响因素小的Bti类产品晶体蛋白含量测定方法，从而更好地控制Bti类产品的质量。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对苏云金芽胞杆菌以色列亚种中毒素蛋白含量测定的空白，提供一种能准确测定苏云金芽胞杆菌以色列亚种中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白含量的方法。本专利技术提供的方法包括以下步骤：1)取苏云金芽孢杆菌以色列亚种待测样品，加入pH为7-9、浓度为0.05-0.2mol/L的磷酸缓冲液，充分混匀后离心，弃去上清，再加入水，充分混匀后离心，弃去上清；2)向收集到的菌泥中加水，充分悬浮，然后再加入氢氧化钠溶液使氢氧化钠终浓度达0.1mol/L，摇匀，静置后再加入样品稀释液，于沸水浴中加热5-10min，冷却后离心，取上清，配制成样品溶液；3)配制SDS-PAGE，加入样品溶液，进行凝胶电泳操作；4)电泳后的胶片经固定、染色、漂洗、脱色、成像，根据蛋白带区域的强度值计算含量。优选地，所述磷酸缓冲液的pH为8.0、浓度为0.1mol/L。优选地，所述SDS-PAGE包括分离胶和浓缩胶，所述分离胶由30％ACR-BIS5mL、pH8.8分离胶胶缓冲溶液3.8mL、ddH2O5.9mL、10％SDS150μL、10％AP150μL、TEMED14μL组成；所述浓缩胶由30％ACR-BIS0.85mL、pH6.8浓缩胶缓冲溶液0.625mL、ddH2O3.4mL、10％SDS50μL、10％AP50μL、TEMED8μL组成。本专利技术针对目前国内外苏云金芽胞杆菌以色列亚种(Bti)中毒素蛋白含量测定的空白，在现有苏云金芽胞杆菌(Bt)毒素蛋白含量测定方法(化工行业标准HG3617-1999)的基础上，通过采用特殊的样品预处理方法，解决了试样中杂质干扰毒素蛋白定量检测的问题，同时对SDS–PAGE凝胶配方进行了优化，进一步改善了凝胶电泳图谱中两种蛋白带的迁移率、分辨率和蛋白带形态，使测得的结果更加准确。其中128KD与65KD毒素蛋白的含量与相应的条带强度呈现良好的线性关系，相关性到达到0.99。本专利技术能同时检测Bti类产品中两种主要毒素蛋白的含量，检测结果准确性高、重复性好，检测误差可以控制在平均值的5％以内。本专利技术能用于Bti类产品的质量控制，具有操作简单易行、快速、成本低、受外界环境影响小等优点。附图说明图1为试样用不同的预处理方法处理后的电泳图，其中1为方法一称样量为30mg电泳图，2为方法一称样量为50mg电泳图，3-5分别为方法二、方法三、方法四电泳图，6-7为方法五重复两次的电泳图，8为方法六电泳图，9-10为方法七重复两次的电泳图。图2为用方法七处理不同质量的Bti样品得到的毒素蛋白电泳图。图3为128KD蛋白带的强度值与Bti毒素蛋白质量的线性关系。图4为65KD蛋白带的强度值与Bti毒素蛋白质量的线性关系。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1方法提要：用磷酸缓冲液和水对苏云金芽胞杆菌以色列亚种原粉进行预处理，减少试样中的杂质干扰，然后用碱性溶液处理原粉中的伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，接着通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其它杂蛋白分离，最后用电泳图像扫描仪扫描蛋白区，根据蛋白带区域的强度值进行定量。1.试剂和溶液四甲基乙二胺(TEMED)。0.55mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠2.2g，用水稀释至100mL。10％过硫酸铵溶液(10％AP)：称取过硫酸铵0.1g，用水稀释至1mL。10％十二烷基硫酸钠溶液(10％SDS)：称取十二烷基硫酸钠10.0g，用水稀释至100mL。0.1mo1/L磷酸缓冲液(pH8.0)：称取无水磷酸氢二钾1.77g至烧杯中，加入0.1mol/L无水磷酸二氢钾溶液6mL(称取磷酸二氢钾13.61g至1L容量瓶中，水定容)，加水溶解，转移至100mL容量瓶中，用水定容至100mL。30％丙烯酰胺(30％ACR-BIS)：称取丙烯酰胺29.0g、亚甲基双丙烯酰胺1.0g，溶于100mL水中，中速定性滤纸过滤，于4℃暗处贮存备用。pH8.8分离胶缓冲溶液：称取三羟基甲基氨基甲烷(Tris)30.25g，溶于水中，用浓盐酸调至pH8.8，用水定容至250mL。pH6.8浓缩胶缓冲溶液：称取三羟基氨基甲烷(Tris)12.10g，溶于水中，用浓盐酸调至pH6.8，用水定容至100mL。pH8.3电极缓冲溶液：称取三羟基甲基氨基甲烷(Tris)3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基磺酸钠(SDS)1.0g，溶于水中，用浓盐酸调至pH8.3，用水定容至1000mL。样品稀释液：1mol/L、pH6.8Tris-HCL缓冲液18.75mL，十二烷基磺酸钠6.0g，甘油30mL，巯基乙醇15mL，少许溴酚蓝，用水定容至100mL。染色液：称取考马斯亮蓝(CBB)R-250l.0g,加入甲醇450mL、冰乙酸100mL、水450mL，溶解混匀，过滤备用。脱色液：量取甲醇100mL、冰乙酸35mL于1000mL容量瓶中，水定容后备用。漂洗液：量取无水乙醇300mL、冰乙酸100mL、水600mL，混匀后备用。固定液：量取75mL冰乙酸于1000mL容量瓶中，水定容。毒素蛋白标准品：毒素蛋白(相对分子量为130KD)含量为11.7％的原粉。2.标样溶液的配制称取毒素蛋白标准品45m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)取苏云金芽孢杆菌以色列亚种待测样品，加入pH为7‑9、浓度为0.05‑0.2mol/L的磷酸缓冲液，充分混匀后离心，弃去上清，再加入水，充分混匀后离心，弃去上清；2)向收集到的菌泥中加水，充分悬浮，然后再加入氢氧化钠溶液使氢氧化钠终浓度达0.1mol/L，摇匀，静置后再加入样品稀释液，于沸水浴中加热5‑10min，冷却后离心，取上清，配制成样品溶液；3)配制SDS‑PAGE，加入样品溶液，进行凝胶电泳操作；4)电泳后的胶片经固定、染色、漂洗、脱色、成像，根据蛋白带区域的强度值计算含量。
【技术特征摘要】
1.一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)取苏云金芽孢杆菌以色列亚种待测样品，加入pH为7-9、浓度为0.05-0.2mol/L的磷酸缓冲液，充分混匀后离心，弃去上清，再加入水，充分混匀后离心，弃去上清；2)向收集到的菌泥中加水，充分悬浮，然后再加入氢氧化钠溶液使氢氧化钠终浓度达0.1mol/L，摇匀，静置后再加入样品稀释液，于沸水浴中加热5-10min，冷却后离心，取上清，配制成样品溶液；3)配制SDS-PAGE，加入样品溶液，进行凝胶电泳操作；4)电泳后的胶片经固定、染色、漂洗、脱色、成像，根据蛋白带区域的强度值计算含量。2.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡凌云，金海燕，刘荷梅，刘华梅，
申请(专利权)人：武汉科诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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