一种小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE分离方法技术

本发明专利技术涉及一种小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS‑PAGE分离方法，其包括如下步骤：醇溶蛋白的去除；麦谷蛋白的还原；麦谷蛋白亚基与样品缓冲液的混合烷化；SDS‑PAGE电泳；本发明专利技术在保持样品分离效果的前提下，减少了试剂的用量和样品制备的步骤，缩短了样品制备的时间。

【技术实现步骤摘要】
一种小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE分离方法
本专利技术涉及一种小麦加工品质改良领域中小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE分离方法。
技术介绍
小麦的麦谷蛋白包括高分子量麦谷蛋白（HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白（LMW-GS），它们与醇溶蛋白一起共同构成小麦的面筋蛋白，在面筋网络中，不同的麦谷蛋白起不同的作用，高分子量麦谷蛋白是面筋网络的主要成分，是面筋网络的骨架，低分子量麦谷蛋白与高分子量麦谷蛋白相连形成有细小枝杈的链状结构，麦谷蛋白的组成直接影响小麦面筋的强弱，是影响小麦加工品质的重要参数，而SDS-PAGE是分析小麦麦谷蛋白组成的常用方法。常规的麦谷蛋白SDS-PAGE分离方法操作较为繁琐，耗时较长，药品用量较多。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种方法简单、分离效果好又节约药品的小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE分离方法。本专利技术采用如下技术方案：一种小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE分离方法，其包括如下步骤：（1）取单粒小麦种子磨碎或取20mg面粉置于2ml离心管中，加1mL提取液A，涡旋混匀后65℃水浴提取30min，水浴期间至少再混匀2次；水浴加热结束后，10000g离心1min，弃上清，得到第一次沉淀；（2）所述第一次沉淀按照步骤（1）重复提取1次，得到第二次沉淀；（3）所述第二次沉淀用0.5mL的提取液A洗一次，10000g离心5min，弃上清，得到待分离沉淀；（4）向所述待分离沉淀中加入100ul含质量体积比为1%二硫苏糖醇的提取液B，涡旋混匀后在65℃水浴提取30min，10000g离心5min；（5）取50ul经过步骤（4）得到的上清液加到50ul含质量浓度为1.0%-0.6%的4-乙烯基吡啶的样品缓冲液C中，涡旋混匀后65℃水浴处理15min，10000g离心5min，取10ul上清进行下一步的SDS-PAGE电泳；（6）采用SDS不连续缓冲系统,分离胶缓冲液为0.375mol•L-1Tris-HCl，pH8.8，0.1%SDS，分离胶浓度10%，浓缩胶缓冲液为0.125mol•L-1Tris-HCl，pH6.8，0.1%SDS，浓缩胶浓度4.8%，分离胶和浓缩胶交联度均为2.6%，电极缓冲液为0.025mol•L-1Tris-HCl，pH8.3，0.192mol•L-1甘氨酸，0.1%SDS，每孔上样量10ul，22℃循环水浴，电流20mA，电泳5.5h；（7）电泳结束后，凝胶在染色液中染色,在脱色液中脱色至背景清晰。分离方法中，所述提取液A为体积分数为30%的异丙醇水溶液。分离方法中，所述提取液B为体积分数为30％异丙醇，0.08mol•L-1Tris-HCl，pH8.0。分离方法中，所述样品缓冲液C为0.08mol•L-1Tris-HCl，pH8.0，2％SDS，40％甘油和0.02％溴酚蓝。分离方法中，所述染色液为10％三氯乙酸，0.05%考马斯亮蓝R-250。分离方法中，所述脱色液为10％乙醇，8％乙酸。本专利技术的有益效果在于：与传统的小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE分离方法相比，本专利技术在不影响分离效果的前提下，减少了试剂异丙醇和4-VP的用量，分离步骤由原来的4步减少为3步，样品的终浓度提高了1倍，样品制备的时间缩短了15分钟。附图说明图1为利用50%和30%异丙醇去除醇溶蛋白后分离得到的麦谷蛋白进行SDS-PAGE分离的效果比较。图1中，A表示用50%异丙醇去除醇溶蛋白；B表示用30%异丙醇去除醇溶蛋白。图2为麦谷蛋白还原时不同异丙醇浓度对麦谷蛋白亚基分离效果的影响。图2中，1、2、3、4、5、6、7分别表示样品还原溶液中含有10%、15%、20%、25%、30%、35%和50%的异丙醇。图3为麦谷蛋白的烷化与样品缓冲液的混合合并为一步后得到的麦谷蛋白与传统方法得到的麦谷蛋白经SDS-PAGE分离后的效果比较。图3中，A表示上样量为10ul，B表示上样量为20ul。1为传统方法，2、3和4分别表示样品缓冲液C中含有1.4%、1.0%和0.6%的4-VP，3和4为本专利技术采用的方法。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细的描述，该实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，并不对保护范围构成限定。供试小麦品种：科农199。主要仪器设备：WD9419型电动粉碎器，北京市六一仪器厂生产；JY-SCZ9型电泳槽，玻璃板规格14x16cm，北京君意东方电泳设备有限公司生产。主要药品：丙烯酰胺和二硫苏糖醇（DTT）上海生工产品；甲叉双丙烯酰胺为Sigma产品；十二烷基硫酸钠（SDS）为Biotopped产品；Tris为Amresco产品；异丙醇由天津市凯通化学试剂有限公司生产；三氯乙酸由天津市科密欧化学试剂有限司公生产；4-乙烯基吡啶（4-VP）购自索莱宝。提取液母液：提取液A1：50％异丙醇；提取液A2：30％异丙醇；提取液B1：10％异丙醇+0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)；提取液B2：15％异丙醇+0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)；提取液B3：20％异丙醇+0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)；提取液B4：25％异丙醇+0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)；提取液B5：30％异丙醇+0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)；提取液B6：35％异丙醇+0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)；提取液B7：50％异丙醇+0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)；样品缓冲液C：0.08mol•L-1Tris-HCl(pH=8.0)+2％SDS+40％甘油+0.02％溴酚蓝。对比例麦谷蛋白亚基的传统提取方法（1）醇溶蛋白的去除：取单粒小麦种子用电动粉碎器磨成粉或取20mg面粉置于2ml离心管中，加1mL提取液A1，涡旋混匀后65℃水浴提取30min，水浴其间至少再混匀2次以便充分提取，10000g离心1min，弃上清，重复提取1次，沉淀用移液枪头挑起后容易混匀，经过2次提取后的沉淀再用0.5mL的提取液A1洗一次，10000g离心5min，弃上清，沉淀用于下一步试验。（2）麦谷蛋白的还原：向上述沉淀中加入100ul含1%DDT(W/V)的提取液B7，涡旋混匀后在65℃水浴提取30min，10000g离心5min。（3）麦谷蛋白亚基的烷化：向上述还原的麦谷蛋白溶液中加入含100ul含1.4%4-VP的提取液B7，65℃水浴处理15min，10000g离心2min。（4）烷化的麦谷蛋白亚基与样品缓冲液的混合：取上述烷化处理后的上清100ul加到含100uL样品缓冲液C的离心管中，简单涡旋后65℃水浴处理15min，10000g离心2min，取20uL上清进行下一步的SDS-PAGE电泳。（5）SDS-PAGE电泳：采用SDS不连续缓冲系统，分离胶缓冲液为0.375molL-1Tris-HCl，pH8.8，0.1%SDS，分离胶浓度10%，浓缩胶缓冲液为0.125molL-1Tris-HCl，pH6.8，0.1%SDS，浓缩胶浓度4.8%，分离胶和浓缩胶交联度均为2.6%，电极缓冲液0.02本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS‑PAGE分离方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）取单粒小麦种子磨碎或取20 mg面粉置于2 ml离心管中，加1 mL提取液A，涡旋混匀后65℃水浴提取30 min，水浴期间至少再混匀2次；水浴加热结束后，10000g离心1 min，弃上清，得到第一次沉淀；（2）所述第一次沉淀按照步骤（1）重复提取1次，得到第二次沉淀；（3）所述第二次沉淀用0.5 mL的提取液A洗一次，10000g离心5 min，弃上清，得到待分离沉淀；（4）向所述待分离沉淀中加入100 ul含质量体积比为1%二硫苏糖醇的提取液B，涡旋混匀后在65℃水浴提取30 min，10000g离心5 min；（5）取50 ul经过步骤（4）得到的上清液加到50 ul含质量浓度为1.0%‑0.6%的4‑乙烯基吡啶的样品缓冲液C中，涡旋混匀后65℃水浴处理15 min，10000g离心5 min，取10 ul上清进行下一步的SDS‑PAGE电泳；（6）采用SDS不连续缓冲系统, 分离胶缓冲液为0.375 mol•L‑1 Tris‑HCl，pH8.8，0.1% SDS，分离胶浓度10%，浓缩胶缓冲液为0.125 mol•L‑1 Tris‑HCl，pH6.8，0.1% SDS，浓缩胶浓度4.8%，分离胶和浓缩胶交联度均为2.6%，电极缓冲液为0.025 mol•L‑1 Tris‑HCl，pH8.3，0.192 mol•L‑1甘氨酸，0.1% SDS，每孔上样量10 ul，22℃循环水浴，电流20 mA，电泳5.5 h；（7）电泳结束后，凝胶在染色液中染色, 在脱色液中脱色至背景清晰。...

【技术特征摘要】
1.一种小麦高低分子量麦谷蛋白亚基SDS-PAGE分离方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）取单粒小麦种子磨碎或取20mg面粉置于2ml离心管中，加1mL提取液A，涡旋混匀后65℃水浴提取30min，水浴期间至少再混匀2次；水浴加热结束后，10000g离心1min，弃上清，得到第一次沉淀；（2）所述第一次沉淀按照步骤（1）重复提取1次，得到第二次沉淀；（3）所述第二次沉淀用0.5mL的提取液A洗一次，10000g离心5min，弃上清，得到待分离沉淀；（4）向所述待分离沉淀中加入100ul含质量体积比为1%二硫苏糖醇的提取液B，涡旋混匀后在65℃水浴提取30min，10000g离心5min；（5）取50ul经过步骤（4）得到的上清液加到50ul含质量浓度为1.0%-0.6%的4-乙烯基吡啶的样品缓冲液C中，涡旋混匀后65℃水浴处理15min，10000g离心5min，取10ul上清进行下一步的SDS-PAGE电泳；（6）采用SDS不连续缓冲系统,分离胶缓冲液为0.375mol•L-1Tris-HCl，pH8.8，0.1%SDS，分离胶浓度10%，浓缩胶缓冲液为0.125mol•L-1Tris-HCl，pH6.8，0.1%SDS，浓缩胶浓度4.8%，分...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴建芳，李春燕，马秀英，王海波，周硕，赵和，吕孟雨，董福双，刘永伟，杨帆，
申请(专利权)人：河北省农林科学院遗传生理研究所河北省农林科学院农产品质量安全研究中心，
类型：发明
国别省市：河北,13