本发明专利技术涉及一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C及应用，该单克隆抗体C是由保藏号为：CCTCC NO:C2017207的杂交瘤细胞分泌的，能够与毒素蛋白PirA表位发生特异性结合。本发明专利技术研制的单克隆抗体C能够与PirA蛋白表位结合，所以使得单克隆抗体C能够应用到AHPND病原的早期快速检测中，为建立AHPND病原的单克隆抗体诊断方法，研究AHPND的发病机理与感染动态、增殖特点、流行病学规律，继而实现切断感染途径、预防控制虾类AHPND奠定了坚实的基础。
Monoclonal antibody C against hepatopancreas pathogenic toxin PirA of shrimp and its application
The present invention relates to a monoclonal antibody C against the toxin protein PirA of shrimp hepatopancreas and its application. The monoclonal antibody C is secreted by a hybridoma cell with the preservation number CCTCC NO: C2017207 and can specifically bind to the toxin protein PirA epitope. The monoclonal antibody C developed by the invention can bind to the PirA protein epitope, so that the monoclonal antibody C can be applied to the early and rapid detection of AHPND pathogen. In order to establish the diagnostic method of the monoclonal antibody of AHPND pathogen, the pathogenesis and infection dynamics, proliferation characteristics, epidemiological law of AHPND are studied, and then realized. Breaking the infection route and preventing and controlling shrimp AHPND laid a solid foundation.
【技术实现步骤摘要】
对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C及应用
本专利技术属于分子免疫学和病原生物学交叉
，是一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C及应用，具体是抗对虾急性肝胰腺坏死病(AcuteHepatopancreaticNecrosisDisease，AHPND)病原毒素蛋白PirA(PhotorhabdusinsectrelatedA，发光杆菌昆虫毒素关联基因A)的单抗及其制备与应用。
技术介绍
急性肝胰腺坏死病(AHPNS)是近年来引起东南亚乃至全球养殖仔虾、幼虾大量死亡的一种疾病。仅在我国，每年造成的直接经济损失超过10亿美元，严重危害对虾产业的发展，已对全球的对虾养殖及相关产业造成了前所未有的打击和影响。对于AHPND的病原，初始研究认为是携带有特定致病性质粒的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)特异菌株，进一步研究发现，该病可能与致病性质粒所携带的PirA和PirB毒素蛋白基因密切相关，台湾成功大学罗竹芳教授团队通过一系列感染实验证实PirAB毒素基因就是诱导AHPND症状的毒素基因，其中PirA约13kDa，PirB约50kDa，且PirAB基因操纵子位于不稳定的序列上，有可能在其他微生物间自由进出。后续研究表明PirA和PirB毒素蛋白的三维结构与苏云金芽抱杆菌分泌的一种昆虫毒素蛋白非常相似，暗示苏云金芽抱杆菌也可能引起对虾肝胰腺的坏死。黄海水产研究所黄倢博士团队发现坎氏弧菌(V.Campbellii)也可导致对虾的AHPND，有证据显示，早先发现的副溶血弧菌在自然条件下可将对虾急性肝胰腺坏死症致病基因PirAB传递给坎氏弧菌，使其成为新的致病菌。目前针对对虾AHPND，仍无有效的防制措施，如何早期诊断该病就迫在眉睫。现有的分子生物学检测技术需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合基层和现场检测，免疫学检测技术可以形成简便快速的现场检测产品，应用免疫学检测技术的关键在于制备高质量的抗体，近年来利用单克隆抗体技术，提高了免疫学检测技术的权威性和特异性，使检测结果更加可靠。但至今尚无对虾AHPND毒素蛋白单克隆抗体研制的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，而提供一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C及应用。本专利技术拟以毒素蛋白PirA基因所表达的多肽为抗原，应用免疫学方法，制备出抗毒素蛋白PirA的单克隆抗体C，为建立AHPND的早期诊断技术及病原受体蛋白的研究提供新的思路。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C，该单克隆抗体C是由保藏号为：CCTCCNO:C2017207的杂交瘤细胞分泌的，能够与毒素蛋白PirA表位发生特异性结合；所述保藏号CCTCCNO:C2017207的杂交瘤细胞名称为杂交瘤细胞株4L16，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2017年12月28日。而且，所述CCTCC—C2017207的杂交瘤细胞是根据推测分析PirA蛋白质氨基酸结构特性，人工设计合成PirA多肽-VLP蛋白载体复合物，然后将得到的PirA多肽-VLP蛋白载体复合物免疫小鼠，将免疫小鼠脾细胞与SP2骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞。而且，所述PirA多肽-VLP蛋白载体表面偶联多个拷贝的多肽序列为SQ2：WTVEPNGGVTEVDS。一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C用于对虾AHPND病原检测的应用。而且，所述对虾AHPND病原检测采用酶联免疫吸附法检测对虾中是否含有携带PirAB质粒的病原。本专利技术的优点和积极效果是：1、本专利技术研制的由杂交瘤细胞分泌的抗AHPND毒素蛋白PirA的单抗C能够与PirA蛋白表位特异性结合，所以使得单抗C可以应用到AHPND病原的早期快速检测中，为建立AHPND病原的单克隆抗体诊断方法，研究AHPND的发病机理与感染动态、增殖特点、流行病学规律等，继而实现切断感染途径、预防控制虾类AHPND奠定了坚实的基础。2、由于本专利技术重要的制备技术路线是：以人工设计合成的PirA多肽-VLP蛋白载体复合物为抗原，免疫小鼠获得脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，采用免疫学检测方法分别以合成多肽、原核表达的PirA蛋白和AHPND病原为抗原筛选融合后的杂交瘤细胞，获得特异性抗AHPND病原毒素天然蛋白PirA的杂交瘤细胞株。这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。3、本专利技术以人工设计合成的PirA多肽-VLP蛋白载体复合物为抗原，免疫小鼠制备抗体。由于AHPND病原毒素蛋白PirA是质粒表达的分泌蛋白，现有方法无法从细菌培养液中准确提纯，而原核表达的蛋白又与天然蛋白在高级结构上会有所差异，因此本专利技术采用人工合成多肽偶联载体蛋白的方法取得抗原，具体方法是：取得PirA全基因序列，采用蛋白分析软件拟合PirA基因所表达蛋白的晶体结构，识别靶标蛋白结构的可能的高级结构区域及表面环状区域，综合选择具有较好的亲水性、暴露于天然蛋白的表面环状区域，按照多肽抗原的设计原则，设计合成12条多肽，并偶联到VLP蛋白载体上，每个蛋白载体表面偶联多个拷贝的多肽序列，形成PirA多肽-VLP蛋白载体复合物。通过人工合成多肽的方法，最大程度的模拟天然蛋白的结构，且每个蛋白载体表面偶联多个拷贝的多肽序列，保证了合成多肽的纯度与免疫原性，为获得高效价、高特异性单抗奠定了基础。采用酶联免疫吸附技术与免疫印记技术结合筛选出的单抗C，能够更加具体的说明本专利技术单抗C与非变性的和变性后的PirA发生特异性结合，为AHPND毒素蛋白的免疫学检测技术提供手段和方法。附图说明图1为抗体制备流程图；图2为PirA蛋白质氨基酸结构特性分析图，其中，细线-表示蛋白结构表面的环状区域；粗箭头-表示蛋白结构中的Beta折叠区域；对应的PirA蛋白氨基酸序列为：(斜体部分为Beta折叠区域对应的氨基酸序列)图3抗PirA重组蛋白抗体与AHPND病原的免疫印迹结果图；图4为显示单抗C分别与PirA重组蛋白和AHPND病原的免疫印迹结果图，其中，图4a为单抗C与PirA重组蛋白的免疫印迹结果图，在57.7kDa处有明显的条带，lane2上样的重组蛋白浓度为10ng，lane3上样的重组蛋白浓度为50ng，lane4为阴性对照，上样量为50ng；图4b为单抗C与AHPND病原的转印免疫印记检测结果图；在15kDa处有明显的显示条带。具体实施方式以下结合附图对本专利技术实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单抗C，其菌株保藏号为CCTCC—C2017207。上述对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单抗C的制备方法包括步骤如下：(1)多肽合成与蛋白偶联根据靶标蛋白PirA蛋白的基因序列SQ13：ATGAGTAACAATATAAAACATGAAACTGACTATTCTCACGATTGGACTGTCGAACCAAACGGAGGCGTCACAGAAGTAGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAAT本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C，其特征在于：该单克隆抗体C是由保藏号为：CCTCC NO:C2017207的杂交瘤细胞分泌的，能够与毒素蛋白PirA表位发生特异性结合；所述保藏号CCTCC NO:C2017207的杂交瘤细胞名称为杂交瘤细胞株4L16，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2017年12月28日。
【技术特征摘要】
1.一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C，其特征在于：该单克隆抗体C是由保藏号为：CCTCCNO:C2017207的杂交瘤细胞分泌的，能够与毒素蛋白PirA表位发生特异性结合；所述保藏号CCTCCNO:C2017207的杂交瘤细胞名称为杂交瘤细胞株4L16，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2017年12月28日。2.根据权利要求1所述的对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体C，其特征在于：所述CCTCCNO:C2017207的杂交瘤细胞是根据推测分析PirA蛋白质氨基酸结构特性，人工设计合成Pir...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓丽，丁子元，王明桥，蔡琰，徐林通，孟逊，
申请(专利权)人：天津市水产技术推广站，艾比玛特医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12
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