针对包含蓝细菌环肽肝毒素的免疫复合物的抗体制造技术

本发明专利技术涉及用于检测含水样品中蓝细菌环肽肝毒素(CCPH)的工具和方法。更具体地，本发明专利技术提供结合一种或多种CCPH变体与抗‑CCPH初级抗体之间形成的免疫复合物的重组抗‑免疫复合物(抗‑IC)抗体和使用该重组抗‑免疫复合物(抗‑IC)抗体的免疫测定法，优选非竞争性免疫测定法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对包含蓝细菌环肽肝毒素的免疫复合物的抗体专利
本专利技术涉及用检测含水样品中蓝细菌环肽肝毒素(CCPH)的工具和方法。更具体地，本专利技术涉及结合一种或多种不同CCPH变体与抗-CCPH初级抗体之间形成的免疫复合物的抗-免疫复合物(抗-IC)抗体和使用该抗-IC抗体的免疫测定法、优选非竞争性免疫测定法。本专利技术还涉及所述抗-IC抗体的用途和包含所述抗-IC抗体的试剂盒，以及编码所述抗-IC抗体的多核苷酸，编码所述多核苷酸的载体，和包含所述载体的分离的宿主细胞。本专利技术还涉及用于制备本专利技术的抗-IC抗体的方法。专利技术背景也称为蓝绿藻的蓝细菌是古老的光合原核生物，其在生态系统中作为主要生产者和氮固定剂具有重要作用。蓝细菌产生数百种生物活性化合物，这些化合物通常是具有多种酶抑制能力的小环肽或具有神经毒性或细胞毒性的不同生物碱。它们的生物活性物质中的一些具有药物潜力，但其中许多可归类为强效哺乳动物生物毒素。最常报告的蓝藻毒素是在一些淡水蓝细菌种中发现的环七肽肝毒素(微囊藻毒素)。微囊藻毒素形成一类超过90种的类似物。虽然相对较少的蓝细菌属产生微囊藻毒素，但不幸的是，主要的生产者生物在世界上最常见的蓝细菌中：微囊藻属(Microcystis)、鱼腥藻属(Anabaena)和浮丝藻属(Planktothrix)。已经在半咸水蓝藻菌节球藻属(Nodularia)中检测到相关的肝毒性五肽(节球藻毒素)。大多数微囊藻毒素和节球藻毒素是强效肝毒素(肝脏毒素)，其急性LD50值为50-600μg/kg(小鼠，腹膜内)。除了急性毒性外，微囊藻毒素和节球藻毒素是肿瘤促进剂和可能的致癌物。微囊藻毒素/节球藻毒素毒性的分子基础是抑制蛋白磷酸酶1和2A。已经报道了在用含毒素的水进行血液透析处理治疗的背景下与微囊藻毒素明显相关的人类死亡。此外，流行病学证据指出暴露于微囊藻毒素的人群肝癌患病率增加。蓝细菌通常在全世界的淡水和半咸水中形成大量出现。这类水华通常是有毒的，导致动物中毒并对人类健康构成威胁。蓝细菌毒素的问题源于使用地表水来制备饮用水和进行娱乐。没有区分毒性和无毒性蓝细菌菌株的形态学标志物。因此，视觉测试是不够的。目前用于蓝藻毒素的分析方法包括竞争性免疫测定，基于酶的蛋白磷酸酶抑制测定(PPIA)和色谱方法，包括使用不同检测器的高效液相色谱(HPLC)，如UV吸光度，荧光或质谱测定(MS)。不幸的是，PPIA不对仅MC具有特异性，并且LC方法由于其复杂性和可用的毒素变体参比材料的数量有限而不适合用于初筛目的。竞争性免疫测定通常基于用MC-LR免疫得到的抗体，且由此具有有限的等同识别多个MC和Nod变体的能力。当存在于所有MC/Nod中的Adda组被特异性靶向时，可以获得更好的覆盖(WO01/18059)。然而，竞争性免疫测定通常比非竞争性测定形式具有更低的总体灵敏度和特异性。由于抗原的小尺寸，尤其是使用基于免疫的传统方法，所以开发用于非竞争性测定形式的次级抗体非常困难。WO2004/046733中公开了一种产生用于检测小分析物的抗体的工具，其描述了产生抗体的方法，所述抗体与初级抗体与其特异性分析物形成的免疫复合物结合，但在很大程度上不结合单独的初级抗体或分析物。该方法基于通过从展示重组结合配偶体文库中选择来获得免疫复合物结合抗体。Nagata等人(Nat.Toxins7:49-55,1999)已经描述了获得上述抗体但使用动物免疫而不是重组结合配偶体文库的不同方法。Nagata等人设法产生部分对由MC-LR和抗-MC-LRmAb形成的免疫复合物具有特异性的三种mAb，并公开了使用它们的非竞争性ELISA测定。然而，例如，由于免疫复合物结合抗体的不良性能特征，该测定法需要一次乃至两次过夜孵育，且因此从实际观点来看是不可接受的缓慢。他们还表明，他们的抗-IC抗体对不含CCPH的初级抗体具有亲和力，这解释了在他们的免疫测定中需要过夜孵育。因此，对于快速、简便和灵敏的抗体存在需求，所述抗体适合于野外和实验室条件下的蓝细菌肝毒素的高流通量一线筛选。专利技术概述在一个方面，本专利技术证实结合由蓝细菌环肽肝毒素(CCPH)和使用包含载体和式(I)的化合物的免疫原生成的抗体形成的免疫复合物的抗体，其中R1是卤原子、-OSO3、-OR’或-NR’R”，R’在结合氮时是氢、取代或未取代的(C1-C4)烷基或(C1-C4)酰基，R”在结合氮时是氢、取代或未取代的(C1-C4)烷基或(C1-C4)酰基，R2是氢、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)酰基、(C1-C4)氨基酰基或(C1-C4)羧基氨基酰基，或R1和R2彼此连接形成环部分，R3是氢或(C1-C4)烷基，且其中苯基可以取代或未取代的。一些实施方案提供组特异性抗体，其识别至少CCPH变体MC-LR、MC-dmLR、MC-LA、MC-RR、MC-dmRR、MC-YR、MC-LY、MC-LF、MC-LW、MC-WR和Nod-R。优选的抗体包括包含如下的抗体：包含与SEQIDNO:5或6中举出的CDR1-3具有至少80％序列特异性的CDR1-3的轻链可变区；和包含与SEQIDNO:30或31中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3的相应的重链可变区。另外优选的组特异性抗体包含与SEQIDNO:5具有至少80％序列同一性的轻链可变区和与SEQIDNO:30具有至少80％序列同一性的重链可变区；与SEQIDNO:6具有至少80％序列同一性的轻链可变区和与SEQIDNO:31具有至少80％序列同一性的重链可变区。一些另外的实施方案提供组特异性抗体，优选这样的组特异性抗体，其包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:15-29的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:40-55的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3。另外优选的组特异性抗体包括这样的组特异性抗体，其包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:15-29的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:40-55的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。此外，一些另外的实施方案提供变体特异性抗体，其包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:7-14的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:32-39的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3。另一些变体特异性抗体包括这样的抗体，其包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:7-14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:32-39的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。本专利技术的另外的方面提供了本专利技术的抗体的不同组。还提供了用于制备本专利技术抗体的方法。该方法包含从重组表达文库得到抗体，该方法通过筛选结合CCPH和使用包含载体和上述举出的式(I)的化合物的免疫原生成的初级抗体的免疫复合物的抗体来进行。还提供了通过这样的方法得到的抗体，并且可以以与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗体，其结合蓝细菌环肽肝毒素(CCPH)和使用包含载体和式(I)的化合物的免疫原生成的抗体形成的免疫复合物，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.21 FI 201559801.抗体，其结合蓝细菌环肽肝毒素(CCPH)和使用包含载体和式(I)的化合物的免疫原生成的抗体形成的免疫复合物，其中R1是卤原子、-OSO3、-OR'或-NR'R”；R'结合氮时是氢、取代或未取代的(C1-C4)烷基或(C1-C4)酰基；R”结合氮时是氢、取代或未取代的(C1-C4)烷基或(C1-C4)酰基；R2是氢、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)酰基、(C1-C4)氨基酰基或(C1-C4)羧基氨基酰基；或R1和R2彼此连接成环状部分；R3是氢或(C1-C4)烷基，且其中苯基可以被取代或未被取代。2.权利要求1的抗体，其中R1是Br。3.权利要求1或2的抗体，其中R3是甲基。4.权利要求1-3任一项的抗体，其中R1是氨基酰基，且R2是(C1-C4)酰基。5.权利要求1-4任一项的抗体，其中R1是甘氨酰基或D-丙氨酰基,且R2是乙酰基。6.权利要求1-5任一项的抗体，其中R1是NH2，且基团R2是谷氨酰基或2-氨基丙酰氨基。7.权利要求1-6任一项的抗体，其中CCPH是微囊藻毒素同源物或节球藻毒素同源物。8.权利要求1-7任一项的抗体，其为组特异性的并且识别至少CCPH变体MC-LR、MC-dmLR、MC-LA、MC-RR、MC-dmRR、MC-YR、MC-LY、MC-LF、MC-LW、MC-WR和Nod-R。9.权利要求8的抗体，包含：轻链可变区，其包含与SEQIDNO:5或6中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3；和相应的重链可变区，其包含与SEQIDNO:30或31中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3。10.权利要求9的抗体，包含：与SEQIDNO:5具有至少80％序列同一性的轻链可变区和与SEQIDNO:30至具有少80％序列同一性的重链可变区；与SEQIDNO:6具有至少80％序列同一性的轻链可变区和与SEQIDNO:31具有至少80％序列同一性的重链可变区。11.权利要求任一项的抗体1-7，其为亚组特异性的。12.权利要求11的抗体，包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:15-29的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:40-55的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3。13.权利要求12的抗体，包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:15-29的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:40-55的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。14.权利要求1-7任一项的抗体，其为变体特异性的。15.权利要求14的抗体，包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:7-14的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:32-39的序列中举出的CDR1-3具有至少80％序列同一性的CDR1-3。16.权利要求12的抗体，包含：轻链可变区，其包含与选自SEQIDNO:7-14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和相应的重链可变区，其包含与选自SEQIDNO:32-39的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。17.权利要求1-16任一项的抗体，其中该抗体是重组抗体或其片段的形式，优选为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv片段。18.权利要求17的抗体，其中该抗体是scFv片段形式，其包含接头肽，该接头肽包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列或其保守序列变体或与SEQIDNO:1具有至少80％序列同一性的变体。19.权利要求1-3任一项的抗体，其中该抗体包含选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·韦赫尼埃宁，U·拉明玛基，S·阿克特，
申请(专利权)人：图尔库大学，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI