抗幽门螺旋杆菌蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种幽门螺旋杆菌抗体及其分泌细胞株、制备方法和用途。本发明专利技术以培养的幽门螺旋杆菌菌体蛋白的超声上清部分为免疫原免疫小鼠，经筛选后获得了可特异结合幽门螺旋杆菌蛋白的抗体15A5，该抗体为IgG2a亚型。该抗体可检测组织或血清中的感染的幽门螺旋杆菌。

Monoclonal antibody against Helicobacter pylori protein and cell strain, preparation method and application thereof

The invention provides a Helicobacter pylori antibody and a secretory cell strain, a preparation method and an application thereof. The supernatant of cultured Helicobacter pylori bacterial protein is used as immunogen to immunize mice. After screening, an antibody 15A5 specifically binding to Helicobacter pylori protein is obtained. The antibody is IgG2a subtype. The antibody can detect Helicobacter pylori infection in tissues or serum.

【技术实现步骤摘要】
抗幽门螺旋杆菌蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗幽门螺旋杆菌蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。
技术介绍
幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，螺旋形、微需氧、Marshall等于1983年首次从胃粘膜组织中分离到幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，简称Hp)，并报道和B型胃炎及消化性溃疡密切相关。世界卫生组织1994年起就将感染幽门螺旋杆菌划定为第一类的致癌风险。世界有过半人口受到过幽门螺杆菌的感染，幽门螺杆菌寄生在胃黏膜组织中，感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，或可发展为胃癌，幽门螺杆菌感染与胃癌死亡率的高低呈现平行关系。此外，从病因学角度讲，它与胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌和原发B细胞淋巴瘤有关。对于HP的检测，最常见的方法包括碳13尿素呼气试验、胃镜结合组织病理检查以及幽门螺旋杆菌抗体检查。PCR方法也是快速准确检测幽门螺旋杆菌DNA的有效方法，免疫学检测方法则包括测定血清中的抗体、补体结合试验、凝集试验、被动血凝测定、免疫印迹技术和酶联合吸附测定(ELISA)以及免疫组织化学法等。无论采用何种免疫学检测方法，对需要特异、敏感的检测抗体。针对不同的用途，抗体的制备策略也有不同，即便是对于免疫检测的用途，因检测样本类型不同、目标蛋白在检样的状态不同以及检样的基质不同而引起的干扰类型不同，在抗原设计和选择过程和抗体的筛选过程中都需要充分考虑。常见的免疫原制备方法包括直接提取或纯化包含目的蛋白的生物样本(如组织裂解液、细胞裂解液、提取自天然组织活细胞的纯化蛋白)，重组表达的抗原蛋白或其片段、化学合成的抗原肽等。针对Hp的菌体抗原制备方法主要包括目前国内外报道不多。整菌抗原、超声粉碎抗原或酸提取抗原。免疫检测方法，以类似的方法，利用全菌或简单分离的菌体蛋白制备幽门螺旋杆菌的抗体简单易行。李妍等用培养的幽门螺旋杆菌超声后用上清和沉淀分别免疫BALB/c小鼠，获得针对Lpp20、HspA、CagA、ureaseA、UreaseB及catalase的抗体共34株，利用这些抗体进行了ELISA检测，无免疫组化检测和抗体对比。(抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备与鉴定，李妍，宁云山，洪燕华，刘宜楚，罗军，龙敏，董文其，李明，南方医科大学学报，2006,26(4)：425-427)，马健也采用这类用全菌免疫，重组蛋白筛选的方法获得了抗尿素酶B和热休克蛋白Hsp60抗体，建立的夹心ELISA方法可以检出25ng/ml的菌体蛋白。将全菌免疫小鼠获得抗体直接标记HRP检测抗体(马健，幽门螺杆菌单克隆抗体的制备及其在免疫检测中的应用，华南理工大学硕士学位论文，2014；马健，倪超，王海鹰，宁正祥.幽门螺旋杆菌单克隆抗体制备及其检测应用.现代食品科技.2015,31(4):228-233.)其他利用全菌免疫的研究也有报道(刘志国等主编，中国幽门螺旋杆菌研究，科学技术文献出版社，1997年出版，临床篇1.2抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备和临床应用)。除兔多抗外，在兽药研究中，鸡IgY也是一类常用的抗体，聂作明等利用菌体蛋白和尿素酶B作为混合抗原免疫母鸡，获得了具有ELISA和免疫印迹检测能力的IgY抗体(聂作明，杨严俊，徐榕榕，盛剑俊.抗幽门螺杆菌卵黄抗体的制备及其效价的评定.食品科学,2005,26(4):232-237)，以开发治疗性Hp抗体为目标，祝捷等用全菌和部分重组蛋白免疫产蛋母鸡制得了具备抑菌效果的IgY抗体(祝捷，杨靖，周永君，潘兴，杨廷敏等，特异性抗幽门螺杆菌卵黄抗体的制备及其抗菌作用研究.中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛,2013)，该抗体为禽源性抗体，暂时只可用于体外细胞实验。利用全菌蛋白制备Hp抗体虽然操作简单，由于涉及免疫的抗原数量很多，所以特异性需要对大量无关菌进行筛选，保证获得特异抗体。利用重组蛋白免疫可以使抗体的识别特异性和生产稳定性得到基本保证。白艳艳等以重组尿素酶B为抗原制备了可以用于ELISA检测的单抗(白艳艳，王兆钺，白霞，缪竞诚，沈飞.幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备、鉴定及应用.中国病理生理杂志,2006,22(3)：622-624.)。陶好霞等也利用类似方法制备了8株不同亚型的抗尿素酶的单抗用于ELISA检测(陶好霞,刘向昕,张兆山.幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定.生物技术通讯,2007,18(2):246-248)。朱虹等制备了针对CagL蛋白的一株IgG类单抗和两株IgM抗体(幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定，江苏大学学报(医学版)，2013,23(3)：238-242)。李丛胜等利用重组的幽门螺杆菌HP0762蛋白，制备了兔多抗克隆抗体，并进行了ELISA和免疫印迹检测，但无免疫组化检测用途的报道(李丛胜，邱炎，王艳春，韩秀萍，陶好霞.幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备.生物技术通讯.2010,21(2):149-153)。用作免疫原的蛋白除脲酶外也包括一些菌体表面糖蛋白，虽然这类糖蛋白往往难以通过原核表达纯化获得与天然蛋白一致的修饰和免疫原性，但仍有研究尝试并获得识别重组抗原的抗体(赵英会，庄东明，杨庆玺，于广福，王玉，张丽青，赵大鹏，张红欣，于爱莲.幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18表达载体构建及其多克隆抗体的制备.中国病原生物学杂志.2013,8(7):592-595)。为检测血液中的幽门螺旋菌感染，利用核酸检测和免疫检测的方法都是可行的，专利技术专利“检测血液中幽门螺杆菌抗原的方法”(公开号：CN1680605)公开了一种利用商业化抗体检测血样中幽门螺杆菌抗原蛋白的方法，专利技术专利“一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用的制作方法”(CN102662059A)则提供了一种利用抗原检测样本中抗幽门螺杆菌抗体的方法。为提高检测的敏感度，可以选择制备菌体多抗获得高亲合力抗体，但多抗的批次间差异较大，难以稳定应用，实践中往往采用多个单抗组合使用的鸡尾酒法，在抗体的技术层面，也可以通过制备双特异抗体达到上述目的，范贵荣等利用VacA和HpaA重组蛋白分别免疫，二次融合的方法获得了可识别两种蛋白的稳定细胞株，这种尝试拓展了抗体的识别能力，但其稳定性和实际应用效果尚待检验(范贵荣，抗幽门螺杆菌VacA和HpaA双特异性单克隆抗体的制备，重庆医科大学，硕士学位论文，2009)。除用于诊断外，制备Hp抗体还有望用于Hp相关肿瘤，叶翠莲等利用重组的HpaA蛋白制备的单克隆抗体进行的细胞抑制实验表明一株单抗可以部分抑制幽门螺旋杆菌对AGS细胞的粘附作用(叶翠莲姜和蔡家利邱容蓉邹姝妹王颖.幽门螺杆菌HpaA蛋白单克隆抗体的制备及其初步应.中国生物制品学杂志,2011.3:83-87)。
技术实现思路
为了克服以上技术问题，提供一种适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测的，具有特异性和敏感性的幽门螺旋杆菌单克隆抗体。所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCCNO15485，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。专利技术人提供了一种抗幽门本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗幽门螺旋杆菌蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNO15485的杂交瘤细胞株产生。

【技术特征摘要】
1.一种抗幽门螺旋杆菌蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNO15485的杂交瘤细胞株产生。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别幽门螺旋杆菌蛋白。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQID1所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQID2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQID3所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID4所示的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨清海，陈惠玲，高惠然，李婷，王小亚，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35