重组全人源抗破伤风毒素单克隆抗体制造技术

本发明专利技术提供了一种重组全人源抗破伤风毒素单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示；所述抗体的轻链CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。本发明专利技术的中和抗体无免疫原性、特异性好、亲和力高、成分清晰、无病原体污染等潜在风险，广泛适用于各种人群，所述制备方法简单高效、适于标准化生产。

【技术实现步骤摘要】
重组全人源抗破伤风毒素单克隆抗体
本专利技术属于细胞免疫学领域，涉及重组全人源抗破伤风毒素单克隆抗体。
技术介绍
破伤风(Tetanus)是由于感染破伤风梭状芽孢杆菌(clostridiumtetani)而引起的急性、致死性的人畜共患神经系统疾病。破伤风梭状芽孢杆菌广泛存在于人、畜的肠道和土壤中，人群携带率高达25％，不同类型和大小的伤口均可成为破伤风梭状芽孢杆菌入侵的门户。当人被感染后，潜伏期内破伤风梭状芽孢杆菌在厌氧条件下于创口处大量繁殖并释放毒素，破伤风毒素通过破坏人体神经细胞而侵害中枢神经系统，导致机体痉挛、四肢强直、角弓反张等症状，最终使人因窒息或呼吸衰竭而死亡。在战争爆发和自然灾害频发时期，破伤风成为一项严峻的公共卫生问题，任何年龄人群均可能发生破伤风感染，死亡率为20-30％，重症患者以及新生儿的死亡率高达80％。破伤风毒素作用迅速，毒性很强。当患者被确诊为感染破伤风杆菌后，体内一般已存在大量细菌和毒素，使用抗菌素已不能挽救患者生命。预防和治疗破伤风的唯一有效的方法是及时注射抗破伤风毒素抗体中和毒素，并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。近年来出现越来越多关于人-鼠嵌合、人源和全人源抗破伤风毒素单克隆抗体的报道。利用B细胞筛选抗体工程技术对全人源单克隆抗体进行改造制备的基因工程抗体不仅消除了血清蛋白引起的过敏反应，而且克服了人源免疫球蛋白生产过程的弊端，具有较好的发展前景。采用基因重组技术，在基因水平上对抗体分子进行改造，形成嵌合抗体，即将鼠抗可变区基因与人IgG恒定区链接；人源化抗体，即将鼠抗可变区的互补决定区移植入人IgG的骨架区中，进一步降低了鼠抗引起的免疫反应；完全人源抗体，该类抗体不含任何外来基因，不会造成过敏反应，是目前基因工程抗体研究的热点之一。然而这些报道的抗体虽然能够与破伤风毒素结合，但中和毒素的效价不高，且抗体的产业化生产问题尚未解决。因此，利用先进的技术，制备一种高效安全的抗破伤风毒素单克隆抗体具有重要意义。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术为了弥补现有技术的不足，本专利技术主要目的在于提供一种无免疫原性、亲和力高、特异性强、效价高的针对破伤风毒素的全人源单克隆抗体，以及编码的序列片段，生产的细胞株和应用进行诊断、预防或治疗的方法和用途。本专利技术提供的抗体可广泛适用于各种人群，所述制备方法简单高效、适于标准化生产。第一方面，本专利技术提供了一种重组全人源抗破伤风毒素单克隆中和抗体，所述抗体包括选自下列的重链可变区(VH):(1)如SEQIDNO.1所示的VHCDR1；(2)如SEQIDNO.2所示的VHCDR2；和(3)如SEQIDNO.3所示的VHCDR3；所述抗体包括选自下列的轻链可变区(VL):(1)如SEQIDNO.4所示的VLCDR1；(2)如SEQIDNO.5所示的VLCDR2；和(3)如SEQIDNO.6所示的VLCDR3；进一步，所述的抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；和/或轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。进一步，所述抗体包含重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。进一步，所述抗体为全人源化抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6、10-7、10-8、10-9或10-10M或更小的平衡解离常数与破伤风毒素解离。本专利技术所述的抗体还包括其功能性变异体。如果抗体的变异体可与本专利技术的抗体竞争以特异性结合破伤风毒素，则它们被认为是本专利技术的抗体的功能性变异体。具体地，如果功能性变异体可结合至破伤风毒素，且具有抗所述亚型或片段的中和活性，则该功能性变异体被认为是本专利技术的功能性变异体。功能性变异体包括(但并不限于)：在一级结构序列中基本类似、但包含本专利技术的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本专利技术的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至破伤风毒素或其片段。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本专利技术的功能性变异体对破伤风毒素或其片段可具有升高或降低的结合亲和力。优选地，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是CDR3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个CDR)和更保守的区域(所谓的构架区域(FR))。高可变区域包括来自CDR的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。意于落入本专利技术的范围内的功能性变异体与本文所定义的亲本单克隆抗体具有至少大约50～99％、优选至少大约60～99％、更优选至少大约80～99％、甚至更优选至少大约90～99％、尤其至少大约95～99％，且特别至少大约97～99％的氨基酸序列同源性。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如Gap或Bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定点诱变(oligonucleotide-directedmutagenesis)和定点诱变(site-directedmutagenesis))改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。本专利技术的抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与本专利技术所述抗体相同功能或改造以及优化的一切抗体。第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本专利技术第一方面所述的抗体的核苷酸序列。第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包含本专利技术第二方面所述的核酸分子。本专利技术中的表达载体包括(但不限于)市场上可广泛买到的pCDNA载体；F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体；植物病毒等。本专利技术中可使用本领域技术人员已知的各种表达载体的任意一种，且表达载体的选择依赖于所选择的宿主细胞的性质。宿主细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的表达载体和宿主细胞的导入方法。优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的宿主细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本专利技术并不是关键性的。为了促进本专利技术的核酸分子的纯化，可将标签(tag)序列插入表达载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或FLAG标签。可在本专利技术中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。第四方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第二方面所述的核酸子和/或如第三方面所述的表达载体。可用于本专利技术的宿主细胞包括但不限于微生物，例如可以是经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全人源抗破伤风毒素单克隆中和抗体，其特征在于，所述抗体包括：SEQ ID NO.1所示的重链CDR1、SEQ ID NO.2所示的重链CDR2、SEQ ID NO.3所示的重链CDR3；以及SEQ ID NO.4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.5所示的轻链CDR2、SEQ ID NO.6所示的轻链CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗破伤风毒素单克隆中和抗体，其特征在于，所述抗体包括：SEQIDNO.1所示的重链CDR1、SEQIDNO.2所示的重链CDR2、SEQIDNO.3所示的重链CDR3；以及SEQIDNO.4所示的轻链CDR1、SEQIDNO.5所示的轻链CDR2、SEQIDNO.6所示的轻链CDR3。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括：重链可变区，所述重链可变区具有SEQIDNO.7所示的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQIDNO.8所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体的平衡解离常数不大于10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖化新，袁晓辉，王月明，郑伟宏，
申请(专利权)人：暨南大学，珠海泰诺麦博生物技术有限公司，广州泰诺迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44