用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段技术

本发明专利技术涉及用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段。本发明专利技术提供了用于在单个宿主细胞中产生一种或更多种免疫球蛋白样分子的手段和方法。也提供了能够产生目的单特异性和/或双特异性免疫球蛋白样分子的新的CH3突变。

【技术实现步骤摘要】
用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段本申请是申请号为201380032276.1的中国专利申请的分案申请，原申请是2013年4月19日提交的PCT国际申请PCT/NL2013/050294于2014年12月18日进入中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及分子生物学、医学和生物治疗剂领域。尤其涉及用于治疗多种疾病的治疗性抗体领域。
技术介绍
许多目前使用的生物治疗剂是分离的重组人或人源化单克隆抗体，其增强机体免疫系统中和或消除参与疾病过程的细胞和/或分子或者消灭侵入的病原体或感染原的能力。单克隆抗体与抗原的单个特定区域或表位结合，并且对于治疗中的使用，通常根据期望的功能性质进行选择，例如杀死肿瘤细胞，阻断受体-配体相互作用或病毒中和。目前，大约有30种经FDA批准的单克隆抗体，这些单克隆抗体通常被大量生产，并且可详细分析其生物物理和生物化学特性以确保批与批之间的一致性，这有助于控制合格率(regulatoryacceptability)。尽管具有这些有利的特性，但是单克隆抗体也有许多缺点，其中一些涉及到其单特异性的性质和疾病的复杂性。疾病过程在性质上常常是多因素的，并且涉及疾病调节因素的繁多的或协同的作用或不同受体的上调，包括其信号网络之间的串扰(crosstalk)。因此，对参与病理的多种不同因素和途径的阻断可导致改善治疗效果。由于其单特异性的性质，单克隆抗体可能仅干扰复杂疾病过程中的单个步骤，这往往不具有最佳效果。除了不能完全解决疾病过程的多个方面外，已经很清楚的是，靶向单个细胞蛋白质或可溶性蛋白质或病原体的单个表位通常不足以有效地治疗疾病，这是因为对于单克隆抗体来说与之结合并发挥所预期效果的靶表位可能不再可利用。例如，肿瘤细胞经常通过下调、突变或屏蔽存在于生长因子受体上的靶表位来逃避单克隆抗体的治疗。通过激活替选受体和/或其配体，肿瘤细胞然后可开发出不同途径来持续生长和转移。类似地，病毒和其他病原体频繁突变并失去或屏蔽靶表位，从而逃避单克隆抗体的治疗。与单个表位结合的单克隆抗体通常不招募由多克隆抗体诱发的全方位的效应机制，其中包括：调理素作用(增强抗原的吞噬作用)、位阻(包被抗体的抗原被阻止附着到宿主细胞或粘膜表面)、毒素中和、凝集或沉淀(抗体结合多个可溶性抗原引起的聚集和随后的清除)，激活补体和抗体依赖性细胞的细胞毒性(抗体能够通过自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞杀伤靶细胞)。用于治疗应用的多克隆抗体可以从混合人血清中获得。这种血清来源的治疗性多克隆抗体可例如用于治疗或预防由病毒(例如狂犬病病毒、巨细胞病毒和呼吸道合胞体病毒)引起的感染、中和毒素(例如破伤风毒素和肉毒杆菌毒素)或预防RhesusD同种异体移植物免疫。以下事实阻止了血清来源的多克隆抗体制剂更广泛的应用：来源血浆仅可用于有限范围的靶标，例如感染性疾病和毒素。此外，在数量和适宜性二者方面，产品高度依赖于供体血液的可用性，导致批次之间相当大的差异。此外，筛选技术跟不上不断进化的病毒，因此，免疫球蛋白产品具有传播传染性疾病的潜在风险。最后，血液采集、筛选和免疫球蛋白纯化的漫长过程意味着血浆来源的免疫球蛋白生产昂贵。单克隆抗体的混合物可以提高单克隆抗体的效力，同时避免了与血清来源的多克隆抗体有关的局限性。在本领域中，已经在临床前模型和临床试验中测试了两种人的或人源化单克隆抗体的组合(例如针对HER2受体的两种单克隆抗体的混合物，针对EGFR受体的两种抗体的混合物、针对狂犬病病毒的两种单克隆抗体)。在本领域中，已经显示出两种单克隆抗体的组合可具有附加效应或协同效应，并且招募与任一单独的抗体都不相关的效应机制。例如，针对EGFR或HER2的两种单克隆抗体的混合物表现为基于下述活性的组合更强效地杀伤肿瘤细胞，所述活性包括：加强受体内化、提高对受体的下游信号通路的阻断，以及增强免疫效应子介导的细胞毒作用。对于基于2种单克隆抗体的组合疗法，组成抗体可分别产生并且在蛋白质水平上组合。这种方法的一个缺点是在临床试验中单独开发2种抗体并且(部分地)用组合重复该过程的费用巨大。这导致基于抗体组合的治疗的成本不可接受。或者，可以将产生组成单克隆抗体的2种重组细胞系在发酵罐中混合，并且可将所得抗体混合物纯化作为单一制剂(WO2004/061104)。这种方法的一个缺点是其组成的控制性差，因此所得重组多克隆抗体制剂的再现性差，尤其是考虑到这样的组成可能在细胞被培养时随着时间而改变，更是如此。在过去的十年中，出现了双特异性抗体来作为使用2种抗体的组合的一种替代选择。虽然，2种抗体的组合代表了与相同或不同靶标上的不同表位结合的2种不同的免疫球蛋白分子的混合物，而在双特异性抗体中，这通过单个免疫球蛋白分子实现。通过与相同或不同靶标上的2个表位结合，双特异性抗体可具有与同相同表位结合之2种抗体的组合相比类似的效果。此外，在单一制剂中由于IgG形式的双特异性抗体与单个分子中的2个不同的单价结合区组合以及2个IgG抗体的混合物与2个不同的二价结合分子组合，也已经观察到了这些形式的不同效果。从技术和管理角度来看，由于制造、临床前试验和临床试验涉及单一分子，这使得开发单一双特异性抗体的复杂性较低。因此，复杂性较低并且具有成本效益的药物开发过程同时提供更有效的抗体治疗，促进了基于单一双特异性抗体的疗法。已通过多种方法产生了基于IgG形式的双特异性抗体，其由两条重链和两条轻链构成。例如，可以通过使两个抗体分泌性细胞系融合以产生新的细胞系或通过用重组DNA技术在单个细胞中表达两种抗体来产生双特异性抗体。这些方法产生了多种抗体，这是因为来自每个抗体的各自的重链可能形成单特异性二聚体(也称为同二聚体)，其包含两个相同的具有相同特异性的配对重链，以及双特异性二聚物(也称为异二聚体)，其包含两个不同的具有不同特异性的配对重链。此外，来自各个抗体的轻链和重链可随机配对形成不适当的、非功能性的组合。这个问题被称为重链和轻链的错配对，可以通过选择用具有共同轻链的抗体表达为双特异性来解决。但即使在使用共同轻链时，在单个细胞中表达两种重链和一种共同轻链也将产生3种不同的抗体种类，即2种单特异性的“亲本”抗体和所述双特异性抗体，所以需要从所得抗体混合物中纯化目的双特异性抗体。虽然已经使用技术来进一步提高双特异性抗体在亲本抗体和双特异性抗体之混合物中的百分率并降低重链和轻链错配对的百分率，但仍需要消除或最小化上面提到的一些缺点的双特异性形式。总之，本领域提供了多种用于产生随后可用于患者中的治疗应用的单克隆抗体、双特异性抗体、单克隆抗体的混合物、或单特异性抗体和双特异性抗体的混合物的技术和方法。然而，如上面所讨论的，每一种这些现有的技术和方法都有其缺点和局限性。因此，需要用于产生靶向多种疾病调节分子(disease-modifyingmolecule)的混合物形式或双特异性方式的生物治疗剂的改进的和/或替代的技术。
技术实现思路
本专利技术提供了用于改进和/.或替选的技术之方法和手段，所述方法和手段用于产生靶向多种疾病调节分子的混合物形式或双特异性方式的生物治疗剂，以及由这些方法和手段得到的产品和用途。在本领域中描述了多种方法来促进某种目的双特异性抗体的形成，从而减少所得混合物中不希望的抗体的含量。对于抗体，众所周本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从单个细胞中产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：a.编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，b.编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带正电的氨基酸残基的替换，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带负电的氨基酸残基的替换，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

【技术特征摘要】
2012.04.20 US 61/635,9351.一种用于从单个细胞中产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：a.编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，b.编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带正电的氨基酸残基的替换，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带负电的氨基酸残基的替换，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。2.权利要求1所述的方法，其还包括为所述宿主细胞提供编码共同轻链的核酸分子。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D。4.权利要求3所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链还包含氨基酸替换L351K。5.权利要求3或4所述的方法，其中所述第二含CH3结构域之多肽链还包含选自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸替换。6.权利要求5所述的方法，其中所述第二含CH3结构域之多肽链还包含氨基酸替换L368E。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中污染性同二聚体的存在少于5％，优选少于2％，更优选少于1％，且最优选污染性同二聚体基本上不存在。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述含CH3结构域之多肽链还各自包含识别靶表位的可变区。9.权利要求8所述的方法，其中所述含CH3结构域之多肽链的2个所述可变区各自识别不同的靶表位。10.权利要求9所述的方法，其中所述不同的靶表位位于相同靶分子上。11.权利要求10所述的方法，其中所述靶分子是可溶性分子。12.权利要求10所述的方法，其中所述靶分子是膜结合分子。13.权利要求9所述的方法，其中所述不同的靶表位位于不同的靶分子上。14.权利要求13所述的方法，其中所述不同的靶分子在相同细胞上表达。15.权利要求13所述的方法，其中所述不同的靶分子在不同的细胞上表达。16.权利要求13所述的方法，其中所述不同的靶分子是可溶性分子。17.权利要求13所述的方法，其中一种靶分子是可溶性分子，而第二种靶分子是膜结合分子。18.权利要求8至10、12至15或17中任一项所述的方法，其中至少一种所述靶表位位于肿瘤细胞上。19.权利要求8至10、12至15或17中任一项所述的方法，其中至少一种所述靶表位位于效应细胞上。20.权利要求19所...

【专利技术属性】
技术研发人员：科内利斯·阿德里安·德克吕夫，林达·约翰娜·阿莱达·亨德里克斯，敦·洛格滕伯格，
申请(专利权)人：美勒斯公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL