一种免疫球蛋白制剂的纯化方法技术

本发明专利技术公开一种免疫球蛋白制剂的纯化方法，特别是一种破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2制剂的纯化方法。本发明专利技术的免疫球蛋白制剂纯化方法，是将待处理的蛋白用免疫亲和层析进行纯化。本发明专利技术方法与现有技术相比更具专一性、高效性、特异性，制备得到的破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2制剂具有高效价、高比活性的特点，且在生产中不依赖于高效价的原料血浆，提高了血浆的利用率，降低了血浆生产企业的成本。

A method for purification of immunoglobulin preparations

The invention discloses a purification method of immunoglobulin preparation, in particular to a purification method of tetanus equine immunoglobulin F (ab') 2 preparation. The purification method of the immunoglobulin preparation of the invention is to purify the protein to be treated by immunoaffinity chromatography. Compared with the prior art, the method of the invention has more specificity, high efficiency and specificity, and the prepared tetanus equine immunoglobulin F (ab') 2 preparation has the characteristics of high titer and high specific activity, and does not depend on the high titer raw material plasma in the production, thus improving the utilization rate of the plasma and reducing the cost of the plasma production enterprise.

【技术实现步骤摘要】
一种免疫球蛋白制剂的纯化方法
本专利技术涉及一种蛋白制剂的纯化方法，确切讲本专利技术涉及一种免疫球蛋白制剂的纯化方法，特别是一种破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2制剂的纯化方法。
技术介绍
破伤风(Tetanus)是破伤风梭菌经由皮肤或黏膜伤口侵入人体，在缺氧环境下生长繁殖，产生毒素而引起肌痉挛的一种特异性感染。因各种原因造成深部创伤的患者，均给予预防或治疗破伤风的药物，一般为破伤风抗毒素。破伤风抗毒素是由破伤风类毒素免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制成的液体抗毒素球蛋白制剂。破伤风抗毒素的生产具有悠久的历史，其生产技术也一直发展变化。破伤风抗毒素的制造方法前后经历过三个发展阶段，最初阶段的“原制血清”制品质量差，不良反应发生率高。第二个阶段制备的“浓制血清”，去除了大部分杂蛋白并使抗毒素蛋白得到了一定的浓缩，质量有较大的改进。第三个阶段是精制抗毒素阶段，自20世纪30年代创建，引入了胃酶消化，加温变性工艺，20世纪80年代在此基础上引入了超滤技术，把胃酶消化、硫酸铵盐析、超滤技术组成一个新的抗毒素生产工艺，即为现有技术中的硫酸铵沉淀工艺，此工艺使制品的外观、透明度、纯度等均有了较大的提高。(参见《医学生物制品学》，第二版，人民卫生出版社，1144)现有技术中的硫酸铵沉淀工艺是生产破伤风抗毒素的通用方法。其原理为高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。该工艺属于粗放提纯过程，纯化的破伤风抗毒素蛋白含量高、比活性低。随着层析技术的发展，在硫酸铵沉淀工艺基础上增加离子交换层析技术，破伤风抗毒素随之升级换代为破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2。离子交换层析是利用蛋白质所带电荷的不同来分离蛋白质，采用不同的pH和(或)离子强度的缓冲液洗脱，使带不同电荷的蛋白质分离。增加离子交换层析工艺后，产品比活性得到了一定幅度的提高，但离子交换层析工艺属于非特异性吸附，不具有专一性，产品的比活性提高幅度有限。关于离子交换层析工艺参见申请号为201610492044.X、名称为《一种无防腐剂的马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法》的中国专利技术专利申请。
技术实现思路
本专利技术提供了一种克服现有技术不足的蛋白制剂的纯化方法。本专利技术的免疫球蛋白制剂的纯化方法是将经胃酶消化、硫酸铵沉淀、超滤处理后的蛋白用免疫亲和层析进行纯化。本专利技术所述的免疫球蛋白制剂的纯化方法特别适用于破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2。优选地，本专利技术所涉及的免疫球蛋白是破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2，其免疫亲和层析所用的层析介质为破伤风类毒素与载体偶联。本专利技术优先的载体为预活化的琼脂糖凝胶，特别是NHS-activatedSepharose4FastFlow、CNBr-activatedSepharose4B、Epoxy-activatedSepharose6B、CNBr-activatedSepharose4FastFlow、CNBr-activatedSepharose6MB、CNBr-activatedBestarose4FastFlow、CNBr-activatedBestarose4B、NHS-activatedBestarose4FastFlow或Epoxy-activatedBestarose6B。优选地，本专利技术所涉及的免疫球蛋白制剂的纯化方法是：先清洗载体，再将载体与配基缓冲体系均置换为pH8.3的0.1MNaHCO3含0.5MNaCl溶液，然后将载体与配基混合在室温下振荡1～4小时或4℃条件下过夜后装柱，使用pH8.3的0.1MNaHCO3含0.5MNaCl溶液冲洗层析柱去除未结合配基，再分别依次用pH8.0的0.1MTris-HCl缓冲液、pH8.0～9.0的0.1MTris-HCl含0.5MNaCl缓冲液和pH3.0～4.0的0.1MHAc含0.5MNaCl缓冲液冲洗层析柱，再将破伤风马免疫血浆经胃酶消化、硫酸铵沉淀、超滤处理后加载到层析柱中，用平衡缓冲液冲洗层析柱至紫外吸收值达到基线，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2溶液，用30～50KD的超滤膜超滤置换缓冲体系至超滤浓缩液蛋白含量为10～40g/L，所述平衡缓冲液为20～50mMPB，含0.1～0.5MNaCl，pH7.0±0.2；所述洗脱缓冲液为0.1～0.5MHAc溶液、0.1～0.5MHAc含0.1～0.5MNaCl溶液、0.05～0.5MGly-HCl溶液或0.05～0.5MGly-HCl含0.1～0.5MNaCl溶液中的一种；所述超滤缓冲液为0.4％～0.7％NaCl溶液。本专利技术采用的免疫亲和层析技术属于特异性配体亲和层析，与现有技术相比更具专一性、高效性、特异性。制备得到的破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2制剂与现有技术相比具有高效价、高比活性的特点，且不依赖于高效价的原料血浆，提高了血浆的利用率，降低了血浆生产企业的成本。附图说明图1按照实施例3制备的破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2制剂亲和层析纯化图谱。图2按照实施例3制备的破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2制剂Superdex200Increase10/300GL检测结果。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步的详细阐述。后述内容中：M指物质的量浓度，单位为mol/L；IU/g指比活性的单位，表示每1g蛋白质所含的抗体效价。以下实施例中，生产所用原料血浆的平均效价为1600IU/ml，未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1处理步骤如下：A.破伤风马免疫血浆的预处理：常温下，将马免疫血浆用注射用水或0.85％氯化钠水溶液搅拌稀释2倍，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，然后按120g/L加入硫酸铵，温度调至25±1℃，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，按3g/L加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。上述滤液按100g/L搅拌加入硫酸铵，调pH至6.8±0.2，温度调至25±1℃，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，按3g/L加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。B.胃酶消化：步骤A的沉淀物用注射用水或0.85％氯化钠水溶液溶解并搅拌稀释，稀释至体积为投产血浆量的2倍，调pH至3.2±0.2，加入胃酶，胃酶加量为每毫升溶液2个活力单位，按稀释液总量的0.1％加入甲苯，在温度30±1℃下消化120min。C.加温变性及一次沉淀：步骤B的溶液按120g/L加入硫酸铵，调pH至5.2±0.2，升温至57±1℃，保持30min。降温至35℃以下，按3g/L加入硅藻土，过滤，收集滤液，废弃沉淀。D.二次沉淀：步骤C的滤液按150g/L搅拌加入硫酸铵，调pH至7.2±0.2，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，按3g/L加入硅藻土，过滤，收集沉淀，废弃滤液。E.明矾沉淀：步骤D的沉淀用注射用水按投产血浆量的1倍溶解并搅拌稀释，按82ml/L加入10％硫酸铝钾溶液，调pH至7.8±0.2，持续搅拌30min，静置60min。开启搅拌，过滤，收集滤液，废弃沉淀。F.超滤：步骤E的滤液澄清过滤后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫球蛋白制剂的纯化方法，将待处理的蛋白用层析法处理，其特征在于所述的层析为免疫亲和层析。

【技术特征摘要】
1.一种免疫球蛋白制剂的纯化方法，将待处理的蛋白用层析法处理，其特征在于所述的层析为免疫亲和层析。2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白制剂的纯化方法，其特征在于所涉及的免疫球蛋白是马免疫球蛋白F(ab’)2。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所涉及的免疫球蛋白是破伤风马免疫球蛋白F(ab’)2，免疫亲和层析所用的层析介质为破伤风类毒素与载体(Matrix)偶联。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所用的载体为预活化的琼脂糖凝胶。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所用的载体为NHS-activatedSepharose4FastFlow、CNBr-activatedSepharose4B、Epoxy-activatedSepharose6B、CNBr-activatedSepharose4FastFlow、CNBr-activatedSepharose6MB、CNBr-activatedBestarose4FastFlow、CNBr-activatedBestarose4B、NHS-activatedBestarose4FastFlow或Epoxy-activatedBestarose6B中的任一种。6.根据权利要求3、4或5所述的方法，其特征在于：先清洗载体去除保护剂，再将载体与配基缓冲体系均置换为pH8.3的0.1MNaHCO3含0.5MNaCl溶液，然后将载体与配基混合在室温下振荡1～4小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：高建军，杨俊杰，包正琦，段丽娟，张光磊，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：甘肃,62