【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及苍术多糖(ap)，具体是苍术多糖(ap)在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法。
技术介绍
1、苍术是一种著名的中草药，在临床上已经使用了数千年，它主要含有多种化学成分，如糖苷、挥发油、有机酸、氨基酸、类黄酮等；苍术素是白术的主要活性成分，研究表明，苍术素可通过抑制肝细胞铁死亡减轻高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(nafld)；据报道，苍术多糖(ap)可通过降低肝脏lps信号和内毒素血症减轻小鼠非酒精性脂肪性肝炎(nash)，近年来，随着对多糖的深入研究，发现多糖具有多种生物活性，如抗衰老、抗氧化、抗炎、保肝、降糖、降脂、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用，改善糖代谢紊乱等，多糖也受到越来越多的关注；因此，我们通过建立蛋氨酸胆碱缺乏饮食(mcd)诱导的nash小鼠模型，探讨苍术多糖(ap)对非酒精性脂肪性肝炎(nash)的预防作用及其潜在机制。
2、但现有的技术存在以下的不足：
3、非酒精性脂肪肝病(nafld)是全球健康负担，非酒精性脂肪性肝炎(nash)是nafld的严重形式，是一种除了脂肪变性外还伴有炎症和肝细胞损伤的致病性疾病；如果不进行干预，nash将进展为纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌；既往研究表明，肝病在我国是一个严重的健康问题，每年约有30～40万人死于肝病；非酒精性脂肪性肝病(nafld)影响全球25％的人口，其中约30％患nash；此外，nash可能导致肝纤维化(25-40％的nash患者)和肝硬化(20-30％的nash患者)；nash的发病机制尚不十分明确，可能与氧化应激、炎症反
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：为了解决非酒精性脂肪肝病(nafld)是全球健康负担，非酒精性脂肪性肝炎(nash)是nafld的严重形式，是一种除了脂肪变性外还伴有炎症和肝细胞损伤的致病性疾病；如果不进行干预，nash将进展为纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌；既往研究表明，肝病在我国是一个严重的健康问题，每年约有30～40万人死于肝病；非酒精性脂肪性肝病(nafld)影响全球25％的人口，其中约30％患nash；此外，nash可能导致肝纤维化(25-40％的nash患者)和肝硬化(20-30％的nash患者)；nash的发病机制尚不十分明确，可能与氧化应激、炎症反应、线粒体损伤、肠道菌群紊乱有关；nash的推荐治疗仍限于生活方式的改变，即调整饮食和适当的体力劳动；因此，探索能够抑制nash的候选药物对其临床研究具有重要的现实意义的问题，提供苍术多糖(ap)在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术为苍术多糖(ap)在制备抗非酒精性脂肪性肝炎中的应用方法，包括：
4、苍术多糖(ap)的应用方法，包括制备方法、结构表征、nash模型的建立和治疗、肝脏表面微血流扫描和生化分析、组织病理学检查、肝脏脂质组学分析、肝脏转录组学分析、蛋白质印记分析、统计分析；
5、苍术多糖(ap)的制备方法：苍术切片，将苍术和水按1：10体积比进行水提，每次100度2小时，水提三次后合并提取液浓缩，加95％乙醇进行沉淀，4℃静置10小时，真空抽滤，滤得沉淀物放真空干燥箱，干燥12小时。
6、通过制备方法，可对苍术多糖(ap)的提取进行全面的准备；且95％乙醇进行沉淀是指保持乙醇最终浓度80％以上；苍术来源于中国内蒙古。
7、作为本专利技术再进一步的方案：所述苍术多糖(ap)的结构表征包括单糖组成的测定、苍术多糖(ap)分子量测定、傅里叶红外光谱；
8、单糖组成的测定：取16种单糖标准品配成标准母液溶液，取各单糖标准溶液精密配置浓度标准品作为混标；根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比；精密称量5mg样品置于安瓿瓶中，加入3m tfa 2ml，80℃水解3h，准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml水涡旋混匀，吸取50μl加入950μl去离子水，12000rpm离心5min，取上清进行ic分析。
9、苍术多糖(ap)分子量测定：使用nacl溶液(0.2m)以0.8ml/min的流速进行洗脱；采用brt105-103-101串联凝胶柱(8×300mm)和差示检测器(rid-20a)获得色谱图和保留时间，绘制标准曲线，得到相对分子质量计算公式，并计算相对分子质量(mp、mw、mw)；
10、傅里叶变换红外光谱：称取样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成，分别置于傅里叶变换红外光谱仪进行扫描记录。
11、标准品(葡聚糖)购自showa denko，单糖标准品购自winherb，总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、非游离脂肪酸检测试剂盒(nefa)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)检测；谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)购于南京建成生物工程研究所；苏木精-伊红(he)和油红o染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司,f4/80抗体购自abcam(美国),抗体购自cst；mcd饲料(由中国江苏营养动物饲料高科技有限公司生产)含有富含l-氨基酸的日粮，其脂肪含量为60kcal％，蛋氨酸含量为0.1％，且不添加胆碱；与之相匹配的mcs饲料也富含l-氨基酸，并含有10kcal％的脂肪以及蛋氨酸和胆碱，同样出自中国江苏营养动物饲料高科技有限公司。
12、作为本专利技术再进一步的方案：所述nash模型的建立和治疗：动物模型及治疗方案:雄性c57bl/6j小鼠40只，5周龄，小鼠被饲养在适宜温度和湿度的条件下，12小时光/暗交替，在实验期间，所有动物自由获得食物和水。雄性c57bl/6j小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，本研究在暨南大学实验动物研究所(中国广州)进行，严格按照相关实验程序进行(动物伦理学编号no：iacuc-20220114-06)；
13、非酒精性脂肪性肝炎(nash)的确切病因尚未完全明确，但大量有关研究发现，nash与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高脂血症等代谢紊乱关系密切；其主要特征为肝细胞大泡性脂肪变伴肝细胞损伤以及炎症，病情严重的患者可发展为肝硬化、肝癌等，危及患者的生存期；mcd饲料是诱导nash动物模型的经典造模方法，通过蛋氨酸胆碱缺乏的饲料促使肝脏线粒体β氧化功能发生障碍，从而建立nash动物模型；该模型主要用于研究nash疾病相关的炎症、氧化应激、线粒体损伤、肝纤维化，该模型具有造模时间短、受个体差异影响小、肝脏炎症均一性和稳定性较好的优势；因此，本文选择mcd饲料喂养c57bl/6j小鼠建立nash模型。
14、作为本专利技术再进一步的方案本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述苍术多糖（AP）的结构表征包括单糖组成的测定、苍术多糖（AP）分子量测定、傅里叶红外光谱；
3.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述NASH模型的建立和治疗：动物模型及治疗方案:雄性C57BL/6J小鼠，5周龄，小鼠被饲养在适宜温度和湿度的条件下，12小时光/暗交替，在实验期间，所有动物自由获得食物和水。
4.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述肝脏表面微血流扫描和生化分析：禁食12h后，用吸入式麻醉机麻醉小鼠，开腹手术后，使用血流成像装置对肝脏表面进行血流扫描，观察并记录血流灌注，用于微循环研究，软件处理模式为空间处理，频率为25Hz，记录时间为1min；
5.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述组织病理学检查：
6.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述肝脏脂质组学分析：将甲醇(0.75mL)添加到100mg肝组织匀浆中，将肝组织匀浆置于玻璃管中，并进行涡旋；
7.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述肝脏转录组学分析：使用NA Nano 6000检测试剂盒对提取的RNA进行质量和数量评估，只有RNA完整性编号大于7.0的样本用于后续分析。
8.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述蛋白质印迹分析：使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从肝组织样本中提取总蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度；用SDS-PAGE在8%的凝胶上分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜上，在室温下用5%脱脂乳在TBST中封闭1小时，以防止膜的非特异性结合，然后将膜与目标蛋白的一抗在4℃孵育过夜，洗膜后，在室温下与hrp标记的二抗孵育1小时，使用增强化学发光(ECL)检测系统对蛋白条带进行可视化，并使用图像分析软件对条带的强度进行定量，将目标蛋白的相对表达量与内参蛋白的表达量进行标准化。
9.根据权利要求1所述的苍术多糖（AP）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述统计分析：采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析，实验结果以均数±标准差表示，P <0.05表示具有显著差异。
...【技术特征摘要】
1.苍术多糖（ap）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的苍术多糖（ap）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述苍术多糖（ap）的结构表征包括单糖组成的测定、苍术多糖（ap）分子量测定、傅里叶红外光谱；
3.根据权利要求1所述的苍术多糖（ap）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述nash模型的建立和治疗：动物模型及治疗方案:雄性c57bl/6j小鼠，5周龄，小鼠被饲养在适宜温度和湿度的条件下，12小时光/暗交替，在实验期间，所有动物自由获得食物和水。
4.根据权利要求1所述的苍术多糖（ap）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述肝脏表面微血流扫描和生化分析：禁食12h后，用吸入式麻醉机麻醉小鼠，开腹手术后，使用血流成像装置对肝脏表面进行血流扫描，观察并记录血流灌注，用于微循环研究，软件处理模式为空间处理，频率为25hz，记录时间为1min；
5.根据权利要求1所述的苍术多糖（ap）在非酒精性脂肪肝性肝炎中的应用方法，其特征在于，所述组织病理学检查：处死小鼠后收集肝组织样本，立即固定于4%多聚甲醛中进行组织病理学检查，固定的组织石蜡包埋，5μm切片，苏木精-伊红染色，进行大体组织学评价，油红o染色评估肝脏脂肪蓄积情况；
6.根据权利要求1所述的苍术多糖（ap）在非酒精性脂肪肝性肝...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉佩，杨钦河，皮大锦，梁正，潘茂兴，郑垂仰，范文，宋庆良，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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