用于杂交瘤细胞培养的补料培养基及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于杂交瘤细胞培养的补料培养基，在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分：葡萄糖10g，谷氨酰胺3g，牛血白蛋白60g，缬氨酸52mg,异亮氨酸54mg,苯丙氨酸35mg,亮氨酸59mg,色氨酸9mg,苏氨酸53mg,蛋氨酸17mg,赖氨酸91mg。本发明专利技术原料配比科学，配制方法简单，制备的补料培养基克服了现有补料培养基存在的批间差，达到了稳定流加培养工艺，稳定提高抗体产量的目的。在采用流加式培养方法时，作为补料培养基，接种培养72小时后，经过纯化的抗体产量不低于300mg/L，且工艺稳定，抗体产量稳定。

【技术实现步骤摘要】
用于杂交瘤细胞培养的补料培养基及其制备方法
本专利技术涉及杂交瘤细胞培养，尤其是涉及一种用于杂交瘤细胞培养的补料培养基，本专利技术还涉及该补料培养基的制备方法。
技术介绍
1975年建立了杂交瘤技术,通过将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞的小鼠脾细胞融合,形成的杂交瘤细胞既能产生抗体又能进行分裂繁殖,且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇,被称为单克隆抗体（简称单抗）。目前单抗主要应用于疾病的预防、诊断和治疗,生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究中。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的趋势,1997年单抗的销售额是50亿美金,此后每年都有大的增长,至2003年已达500亿美金,由此可见单抗技术是生物
中升起的一颗新星。2000-2010年，全球单克隆抗体药物市场的复合增长率高达32%。2011年,单克隆抗体药物继续领跑全球药品市场，全球生物制药产品的市场规模过亿美元,占生物制药产品的25%。有研究数据表明,生物制药产品今后几年在全球市场上的占比将明显上升。目前国内外实验室广泛采用的大量制备单抗的方法主要有两种：一是体外培养法，二是动物体内生产法。杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞,因此既可以进行单层细胞培养,又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段,即将杂交瘤细胞加入培养瓶中,以含小牛血清的培养基培养,杂交瘤细胞浓度1.0×107个/皿，然后收集培养上清，其中单抗含量0.3mg/皿。由于上述方法制备的单抗量极为有限,无疑不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量高密度培养,单位体积内细胞数量越多,杂交瘤细胞存活时间越长,单抗的浓度就越高,产量就越大。杂交瘤细胞的悬浮培养法中，如果小规模悬浮培养，则多采用转瓶进行培养,通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养，则多采用发酵式的生物反应器进行培养，其培养方式可分为纯批式培养和流加式培养。由于纯批式培养细胞活率下降快，导致抗体产量不高，故应用较少。流加式培养，由于可通过流加补料培养基来延长细胞的存活时间，大大提高了抗体产量。但是现有的补料培养基国外厂商的质量好但售价高，增加了生产成本；国内厂家补料培养基配方不稳定，存在批间差，使用后导致抗体分泌量下降，无法满足生产需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种批间差异小、质量品质一致的用于杂交瘤细胞培养的补料培养基，本专利技术还提供该补料培养基的制备方法。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的用于杂交瘤细胞培养的补料培养基，在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分：葡萄糖10g，谷氨酰胺3g，牛血白蛋白60g，缬氨酸52mg,异亮氨酸54mg,苯丙氨酸35mg,亮氨酸59mg,色氨酸9mg,苏氨酸53mg,蛋氨酸17mg,赖氨酸91mg。本专利技术用于杂交瘤细胞培养的补料培养基的制备方法包括下述步骤：第一步，将800ml注射用水在烧杯中加热至30~35℃，将缬氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,色氨酸,苏氨酸,蛋氨酸,赖氨酸陆续加入到烧杯中，边加边搅拌，使之充分溶解；第二步，待第一步中所有原料充分溶解后，再将葡萄糖，谷氨酰胺，牛血白蛋白依次加入到烧杯中，边加边搅拌，使之充分溶解；第三步，待第二步中添加的原料充分溶解后，将溶液定容至1000ml，经除菌过滤器过滤后，得到补料培养基成品。所述除菌过滤器的过滤精度为0.2μm。本专利技术的优点在于原料配比科学，配制方法简单。采用葡萄糖、谷氨酰胺、牛血白蛋白和氨基酸构成补料培养基的配方，其中其中葡萄糖主要提供细胞生产所需的碳源，谷氨酰胺既可作为碳源也是核苷合成的重要成份，氨基酸是蛋白质合成的必需原料。本专利技术制备的补料培养基克服了现有补料培养基存在的批间差，达到了稳定流加培养工艺，稳定提高抗体产量的目的。在采用流加式培养方法时，作为补料培养基，接种培养72小时后，经过纯化的抗体产量不低于300mg/L，且工艺稳定，抗体产量稳定。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术做更加详细的说明。本专利技术所述的用于杂交瘤细胞培养的补料培养基，在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分：葡萄糖（分析纯）10g，谷氨酰胺（生化试剂）3g，牛血白蛋白（生化试剂）60g，缬氨酸（生化试剂）52mg,异亮氨酸（生化试剂）54mg,苯丙氨酸（生化试剂）35mg,亮氨酸（生化试剂）59mg,色氨酸（生化试剂）9mg,苏氨酸（生化试剂）53mg,蛋氨酸（生化试剂）17mg,赖氨酸（生化试剂）91mg。本专利技术的补料培养基制备时，制备条件和设备：环境气压为一个大气压，环境温度为室温。按以下配比准确称量下述原料：葡萄糖10g，谷氨酰胺3g，牛血白蛋白60g，缬氨酸52mg,异亮氨酸54mg,苯丙氨酸35mg,亮氨酸59mg,色氨酸9mg,苏氨酸53mg,蛋氨酸17mg,赖氨酸91mg；注射用水1000ml备用。其制备方法如下：第一步，首先将800ml注射用水倒入烧杯中加热至30~35℃，将缬氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,色氨酸,苏氨酸,蛋氨酸,赖氨酸陆续加入到烧杯中，边加边搅拌，原料全部加入后持续搅拌约10min，使之充分溶解，液体透亮，无杂质；第二步，待第一步中所有原料充分溶解后，再将葡萄糖，谷氨酰胺，牛血白蛋白依次加入到烧杯中，边加边搅拌，原料全部加入后持续搅拌约10min，使之充分溶解，液体透亮，无杂质；第三步，待第二步中添加的原料充分溶解后，将溶液定容至1000ml，经0.2μm的除菌过滤器过滤后，得到补料培养基成品，4℃、密封保存。使用时，每次添加培养体积的5%，每24小时添加一次，细胞活率降至20%以下后，停止添加，并收取培养液。下面分别使用进口、国产、本专利技术实施例自制三种补料培养基，在摇床上进行流加式培养对比验证。过48小时培养，进行1000rpm、10min离心收取上清,使用亲和层析柱纯化抗体，并使用A280检测抗体含量，结果见表1。表1结论：从以上三种补料培养培养的结果可以看出，相比阴性对照，抗体产量都有所提升。本专利技术实施例自制的产量高于国产的64.5%，低于进口约7.3%。从产量看进口最优，但从成本、产量、技术进步等综合方面考量，本专利技术自制的补料培养基具有更大的优势。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于杂交瘤细胞培养的补料培养基，其特征在于：在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分：葡萄糖 10g，谷氨酰胺 3g，牛血白蛋白60g，缬氨酸 52mg,异亮氨酸 54 mg,苯丙氨酸35 mg,亮氨酸59 mg,色氨酸9 mg,苏氨酸53 mg,蛋氨酸17 mg,赖氨酸91 mg。

【技术特征摘要】
1.一种用于杂交瘤细胞培养的补料培养基，其特征在于：在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分：葡萄糖10g，谷氨酰胺3g，牛血白蛋白60g，缬氨酸52mg,异亮氨酸54mg,苯丙氨酸35mg,亮氨酸59mg,色氨酸9mg,苏氨酸53mg,蛋氨酸17mg,赖氨酸91mg。2.权利要求1所述用于杂交瘤细胞培养的补料培养基的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：第一步，将800ml注射用水在烧杯中加热至30~35℃，将缬氨酸,异亮...

【专利技术属性】
技术研发人员：周伟伟，周雷鸣，孙静静，赵巧辉，李桂林，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41