用于筛选核酸适配体的方法技术

本发明专利技术涉及用于筛选核酸适配体的方法，其包括下述工序：(a)使固定于固相载体上的靶分子与核酸适配体候选物接触，(b)通过毛细管电泳来分选已与靶分子结合的核酸适配体候选物，(c)通过PCR对核酸适配体候选物进行扩增。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于筛选核酸适配体的方法
本专利技术涉及用于筛选核酸适配体的方法。
技术介绍
所谓核酸适配体，是指具有分子识别能力的单链DNA或RNA，于1990年由Ellington等人和Tuerk等人首次报道。核酸适配体可通过被称为指数富集配体系统进化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment，SELEX)的进化工程学方法获得，也已报道了大量的具有能与抗体相匹敌的结合能力、特异性的核酸适配体。此外，能够针对以蛋白质、细胞为代表的难以取得抗体的低分子化合物这样的各种靶标而取得适配体，在治疗药、诊断药中的应用受到期待。然而，抗体的获得概率据称为90％以上，与此相对，目前的核酸适配体的获得概率据称为30％以下。即，可以说核酸适配体的获得概率的技术性提高是今后要将核酸适配体在产业上广泛应用时所面临的主要课题。核酸适配体作为代替抗体的新型的分子识别成分而受到关注，但一般认为核酸适配体的获得率为30％以下，期望开发出高效的适配体获得方法。CE-SELEX是利用了毛细管电泳的优异的分离能力的快速筛选核酸适配体的方法。然而，由于实验条件设定(分选区域的设定)的难度、作为靶标的分子必须为在与ssDNA文库结合时电泳迁移率大幅变化这样的一定程度以上的大小的限制，不能否认其缺乏通用性。CE-SELEX中，分选区域的设定是影响适配体获得率的重要的要素。需要将未混入不具有对靶标的结合能力的ssDNA文库的、确实地包含与靶标形成了复合体的ssDNA文库的区域分选出来。理想的分选区域是来自ssDNA文库与靶标的复合体的峰的范围。然而，靶分子为MutS蛋白那样容易与ssDNA发生相互作用的分子，并且，只要不使用高灵敏度的荧光检测器，就难以检测出ssDNA文库与靶标的复合体。此前，为了优化分选区域，已尝试了多种方法：通过荧光修饰而使靶蛋白质可视化，通过实时PCR来预测靶标-适配体复合体的检测位置，等等。然而，仍然难以检测出复合体，通常是将从靶分子的检出位置开始至即将检出ssDNA文库之前为止的区域作为分选区域。该分选区域的设定方法中，存在下述这样的问题：在中途解离的结合能力低的序列也容易被包含在分选区域中(图1A)。另外，在将低分子化合物等小分子作为靶标时，几乎不能期待与ssDNA文库结合时的电泳迁移率变化，因此，认为难以应用CE-SELEX。通过CE-SELEX获得针对低分子化合物的适配体的例子迄今只有一例，由此也可窥见其难度(非专利文献1)。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Yang,J.&Bowser,M.T.CapillaryElectrophoresis-SELEXSelectionofCatalyticDNAAptamersforaSmall-MoleculePorphyrinTarget.Anal.Chem.85,1525-1530(2013).
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术提供在有效发挥CE-SELEX的优点的同时、解决了实验条件设定的难度、可应用的靶分子种类少这样的缺陷的新型CE-SELEX。具体而言，本专利技术涉及组合了粒子和CE-SELEX的用于筛选核酸适配体的方法。此前虽然报道了组合了粒子和毛细管电泳的RNA、抗原的定量分析方法，但尚未报道组合了粒子和CE-SELEX的方法。用于解决课题的手段本申请的专利技术人进行了深入研究，结果发现，通过将粒子与CE-SELEX组合能解决以往的课题，从而完成了本专利技术。本专利技术涉及以下方案。[1]用于筛选核酸适配体的方法，其包括下述工序：(a)使固定于固相载体上的靶分子与核酸适配体候选物接触，(b)通过毛细管电泳来分选(日文：分取)已与靶分子结合的核酸适配体候选物，(c)通过PCR对核酸适配体候选物进行扩增；[2]如[1]所述的方法，所述方法还包括下述工序：(d)使扩增而得到的PCR产物成为单链；[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，固相载体为粒子；[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，粒子的粒径的最小值为0.05μm；[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，靶分子为蛋白质或低分子量化合物；[6]如[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，核酸适配体候选物为单链DNA文库；[7]如[2]～[6]中任一项所述的方法，其中，最多反复进行3次工序(a)～(d)。关于固相载体，可使用能将靶分子固定在其表面上的任意的固相载体。可举出例如层状的石墨烯、碳纳米管、富勒烯及粒子。关于粒子，可使用现有已知的任意的粒子。例如，可举出二氧化硅珠、聚苯乙烯珠、胶乳珠、金属胶体。本专利技术的粒子可以是磁性粒子。粒子的平均粒径的最大值可根据毛细管的内径确定。优选为100μm，更优选为10μm，进一步更优选为1μm。粒子的平均粒径的最小值优选为100nm，更优选为10nm，进一步更优选为1nm。粒子的平均粒径可利用已知的任意方法确定。例如，筛分法、显微镜法、沉降法、激光衍射散射法、电气检测法。优选为显微镜法。为了不使用昂贵的荧光检测器、而使用可见光部的吸光度检测器，粒子需要具有对于通过可见光的散射来进行检测而言充分的粒径。此时的粒子的平均粒径的最小值优选为0.05μm，更优选为0.5μm，进一步更优选为5μm。本专利技术中所谓靶分子，是指在利用了核酸适配体的检测方法等中作为检测的靶标的分子。靶分子的化学种类没有特别限制，可包含低分子化合物、高分子化合物、及来自生物体的物质等各种化学种类。另外，可将靶分子固定于固相载体的表面。更具体而言，可举出例如糖类、脂质类、低聚肽、蛋白质、及核酸。作为靶分子功能，可举出例如抗原、抗体、配体、受体、相互作用蛋白等。本专利技术中所谓核酸适配体，是指对于规定的靶分子的亲和性高、能与其特异性地结合的核酸分子。将具有这样的性质的核酸分子称为核酸适配体，只要没有特别说明，则不受碱基序列、分子的大小、分子的立体结构等的限制。优选核酸适配体为单链的RNA或DNA。本专利技术中所谓固定于固相载体上的靶分子，是指靶分子通过疏水性相互作用、静电相互作用、共价键、配位键、非共价键性的分子间相互作用(生物素-链霉亲和素等)等而被固定于固相载体表面。本专利技术中所谓核酸适配体候选物，是指由多种RNA及/或DNA构成的候选库(pool)。优选为由单链的核酸形成的单链核酸文库，更优选为由单链的DNA形成的单链DNA文库。需要说明的是，在其一部分中也可包含通过单链核酸中的全部或一部分碱基发生相互对合而形成的双链核酸。本专利技术中所谓毛细管电泳，是指下述方法：通过在毛细管内装满水溶液、导入包含目标物的水溶液并放置于电场中，从而发挥电荷的移动和亲和性、电渗流等的作用，能进行分离纯化。关于毛细管的内径，可使用任意的内径的毛细管。本专利技术中，通过毛细管电泳来分选已与靶分子结合的核酸适配体候选物。在毛细管电泳系统中设置预先进行了前处理的毛细管。然后，注入混合ssDNA文库和固定有靶标物质的粒子而成的样品，然后，在运行缓冲液(runningbuffer)中进行电泳。在电泳期间，例如，可以随时间经过而利用二极管阵列检测器测定195、260、280、550nm等波长处的吸光度，将得到的峰作为指标，进行磁性粒子部分的回收((a)工序及(b)工序)。本专利技术中，通过PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于筛选核酸适配体的方法，其包括下述工序：(a)使固定于固相载体上的靶分子与核酸适配体候选物接触，(b)通过毛细管电泳来分选已与靶分子结合的核酸适配体候选物，(c)通过PCR对核酸适配体候选物进行扩增。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.22 JP 2016-0104151.用于筛选核酸适配体的方法，其包括下述工序：(a)使固定于固相载体上的靶分子与核酸适配体候选物接触，(b)通过毛细管电泳来分选已与靶分子结合的核酸适配体候选物，(c)通过PCR对核酸适配体候选物进行扩增。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括下述工序：(d)使扩增而得到的PCR产...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉本敬太郎，和久井幸二，古性均，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，日产化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP