针对FGF2的适体及其应用制造技术

本发明专利技术提供例如下述：具有对FGF2的抑制活性的适体；包含具有与FGF2的结合活性和对FGF2的抑制活性的适体和功能性物质(例如，亲和性物质、标记物质、酶、药物递送介质或药物等)的复合物；和药物、诊断试剂或标记试剂，其包含：具有与FGF2的结合活性和对FGF2的抑制活性的适体，或包含所述适体和功能性物质的复合物；等等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及针对FGF2的适体、使用其的方法等。
技术介绍
碱性成纤维细胞生长因子(FGF2或bFGF)是由多种细胞分泌的生长因子，其深入地参与发育阶段的细胞增殖和分化，并且在组织修复过程中和在成年人的癌组织中表现出高表达。尽管人FGF2具有多种同工型，但是仅具有最低分子量的一种同工型被分泌到细胞外。该同工型是由154个氨基酸组成的大约18kDa的蛋白，其不含糖链，并且具有9.4的碱性等电点。尽管目前尚不清楚FGF2的具有不同开放阅读框的高分子量同工型(22,22.5,24,34kD)的功能，但是认为它们具有核定位信号并且在细胞核中起作用。已知人FGF家族蛋白包括22种，从FGF1到FGF23(现在FGF15和FGF19被统称为FGF19，原因在于它们是相同的分子)。通过系统发生分析，将FGF2与FGF1一起分类为FGF1亚家族。与FGF1的氨基酸序列同源性是所有FGFs中最高的，并且其值为55％。FGF受体(FGFR)是受体酪氨酸激酶，并且分类成4个亚型。已知FGFR1–3的每一个包括b和c同工型。FGF2结合FGFR1b、FGFR1c、FGFR2c和FGFR3c，并且FGFR4由此使这些受体二聚体化。小鼠成纤维细胞(NIH-3T3细胞)在细胞膜表面上表达FGFR1。已知FGFR1在与人FGF2结合时被激活。当FGF2与FGFR1结合时，MAP激酶(丝裂元激活的蛋白激酶)途径、PIK3(磷脂酰肌醇3激酶)/AKT1(蛋白激酶B)途径等通过FRS2(成纤维细胞生长因子受体底物2)、Grb2(生长因子受体结合的蛋白2)、SOS激活，并且，最终诱导多种细胞因子和受体基因(诸如VEGF(血管内皮生长因子前体)-A、VEGF-C、HGF(肝细胞生长因子)、血管生成素-2、VEGFR、PDGFR-α(血小板来源的生长因子β受体-α)等)的表达。FGF2具有肝素结合区，并且，如同其他FGFs，结合肝素和硫酸脱乙酰肝素。通常，认为从细胞分泌的FGF2与细胞外基质的硫酸脱乙酰肝素结合，浓缩，并且保护免受蛋白酶降解。为了作为配体行使功能，FGF2需要从与其结合的细胞外基质释放，其中FGF-BP(FGF-结合蛋白)被报道参与辅助针对FGFR的诱导。已知FGF2具有强烈的促进血管内皮细胞生长、细胞迁移的作用，并且深入参与肿瘤组织的血管发生。已经报道了在具有许多血管的肿瘤(例如，肾癌等)中特别高的FGF2血清浓度，并且FGF2存在于多种其他肿瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等。除了FGF2之外，诸如FGF1、VEGF、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、PDGF、EGF(表皮生长因子)、MMP(基质金属肽酶)、血管生成素等因子参与血管生成。这些因子由肿瘤、成血管细胞、支持细胞等分泌，并且作为自分泌和旁分泌的生长因子而有助于血管生成。然而，FGF2不同于其他因子，原因在于其不仅作用于血管内皮细胞，还作用于内皮细胞周围的间充质细胞，诸如平滑肌细胞等。换言之，认为FGF2刺激间充质细胞，从而促进PDGF、PDGFR、VEGF、HGF等的表达，并且这些因子增强血管内皮细胞的直接生长。目前，已经进行了许多尝试来研发抑制肿瘤组织中的异常血管生成从而阻断对肿瘤组织的营养供应途径的药物。存在实际上用在临床情形中的药物，诸如由Genentech研发的人源化抗-VEGF单克隆抗体(阿瓦斯丁(avastin)(注册商标))，已经证实其表现出针对结肠癌和非小细胞肺癌的作用。然而，还没有研发出强抗肿瘤药物。这些药物中的很多种靶向VEGF和PDGF，并且预测通过靶向在更上游起作用的FGF2而阻断异常血管生成的初始阶段。除了肿瘤之外，异常的血管生成还参与诸如慢性炎症(例如，牙周病(periodontal disease)，硬皮病(scleroderma)，新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)，关节炎(arthritis)等)、银屑病(psoriasis)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)等的疾病。另一方面，已经尝试利用FGF2的强血管生成作用治疗闭塞的血管病症和伤口愈合。事实上，Kaken制药有限公司(Kaken Pharmaceutical Co.，Ltd.)的人FGF2制剂(FIBLAST(注册商标)喷雾剂)已经获得核准，并且作为促进伤口愈合的药物销售。尽管已知FGF2具有促进骨骼发生的作用，但是，由于其参与慢性类风湿性关节炎患者中的关节破坏，其也作为促进骨质吸收的因子而引起注意。在以自身免疫性关节炎为特征的慢性类风湿性关节炎中，破骨细胞的数量增加，以促进骨质吸收，其又促进骨质破坏。FGF2刺激间充质细胞从而促进炎性细胞因子和生长因子(如PDGF，PDGFR，VEGF，HGF等)的表达，以及促进血管生成并诱导骨质破坏。已经阐明FGF2是参与慢性类风湿性关节炎的重要病理学的关键分子(非专利文献1)。骨保护素(OPG)是破骨细胞诱导剂RANKL的诱饵受体，并且已知拮抗RANK并且阻抑向破骨细胞的分化诱导和它们的功能(非专利文献2)。还已知由滑膜细胞产生的OPG受FGF2刺激的阻抑(非专利文献3)。此外，FGF2通过诱导成骨细胞高表达RANKL而促进成骨细胞与破骨细胞前体的偶联，结果促进向破骨细胞的分化和激活(非专利文献4)。一旦可以控制FGF2的功能时，应该充分预期通过激活破骨细胞作为关节破坏的治疗药物的效用。事实上，已知向AIA模型大鼠直接关节施用抗-FGF2中和抗体缓和症状。然而，对其发作的阻抑作用小，并且特别地，还没有证实在发作后通过给药的治愈作用(非专利文献5)。近年来，应用于药物、诊断试剂和检测试剂的RNA适体已经引起注意；一些RNA适体已经处于临床研究阶段或实际使用中。在2004年十二月，世界上第一个RNA适体药物，Macugen，在美国被批准作为年龄相关性黄斑变性的治疗药物。RNA适体是指特异地结合目标物质(诸如蛋白)的RNA，并且能够使用SELEX(指数富集的配体系统进化)方法来制备它(参见专利文献1-3)。在SELEX方法中，特异结合目标物质的RNA选自具有大约1014个不同核苷酸序列的RNA库。所用的RNA结构具有大约40个残基的随机序列，引物序列在所述随机序列的侧翼。允许此RNA库与目标物质混合，并且使用滤器等仅收集与目标物质结合的RNA。通过RT-PCR扩增收集的RNA，并且使用此作为下一轮的模板。通过重复此操作大约10次，有时可以获得特异结合目标物质的RNA适体。专利文献4描述了结合FGF2的适体，其通过上述SELEX法获得。然而，该适体的序列与本说明书中具体显示的适体的序列不同。另外，该文献没有提示本说明书中具体显示的适体。[文献列表][专利文献]专利文献1:WO 91/19813专利文献2:WO 94/08050专利文献3:WO 95/07364专利文献4:WO 2011/099576[专利文献]非专利文献1:Manabe N.等Reumatology.1999；38；714-720非专利文献2:Yasuda H.等Proc.Natl.Acad.Sci USA.1998；95；3597-3602非专利文献3:Yano K.等J本文档来自技高网...

【技术保护点】
结合FGF2的适体，其包含由以下式(1)所示的核苷酸序列(其中尿嘧啶可选地是胸腺嘧啶)，并且其是下述(a)或(b)：N1GGAN2ACUAGGGCN3UUAAN4GUN5ACCAGUGUN6(式1)N1和N6分别独立地是任意0至数个碱基，N2，N3，N4和N5独立地是任意一个碱基，(a)一种适体，其中，在所述适体包含的核苷酸中，(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2’‑位是氟原子，(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2’‑位是羟基；(b)(a)的适体，其中(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2’‑位上的氟原子独立地是未取代的，或被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组的原子或基团取代，(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2’‑位上的羟基独立地是未取代的，或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.24 JP 2014-0609661.结合FGF2的适体，其包含由以下式(1)所示的核苷酸序列(其中尿嘧啶可选地是胸腺嘧啶)，并且其是下述(a)或(b)：N1GGAN2ACUAGGGCN3UUAAN4GUN5ACCAGUGUN6(式1)N1和N6分别独立地是任意0至数个碱基，N2，N3，N4和N5独立地是任意一个碱基，(a)一种适体，其中，在所述适体包含的核苷酸中，(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位是氟原子，(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位是羟基；(b)(a)的适体，其中(i)每个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位上的氟原子独立地是未取代的，或被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组的原子或基团取代，(ii)每个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位上的羟基独立地是未取代的，或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代。2.根据权利要求1所述的适体，其中N1是G，GG，AG，C或是缺口，N2是A或U，N3是G，C或A，N4是G，C或U，N5是G或U，和N6是UUCN61或AGUCN62，其中N61和N62分别独立地是任意0至数个碱基。3.根据权利要求1或2所述的适体，其包含由以下式(2)或(3)所示的核苷酸序列：GGGAAACUAGGGCGUUAACGUGACCAGUGUUUCN61(式2)N1GGAUACUAGGGCAUUAAUGUUACCAGUGUAGUCN62(式3)。4.根据权利要求1-3中任一项所述的适体，其包含SEQ ID NO:2或7所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1-3中任一项所述的适体，其包含SEQ ID NO:1，3，4，5，6，8，10或11所示的核苷酸序列。6.根据权利要求1-5中任一项所述的适体，其中1个或数个核苷酸被取...

【专利技术属性】
技术研发人员：金玲，
申请(专利权)人：力博美科股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP