针对胃促胰酶的适配体及其应用制造技术

本发明专利技术提供适配体，其是与胃促胰酶结合的适配体，且该适配体包含UAACR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对胃促胰酶的适配体及其应用
本专利技术涉及针对胃促胰酶(chymase，糜酶)的适配体及其利用方法等。
技术介绍
人胃促胰酶(EC.3.4.21.39)是胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的一种，储存在肥大细胞的分泌颗粒中。若肥大细胞受到外部刺激则发生脱颗粒，使人胃促胰酶与各种炎症介质一同被释放到细胞外。释放的人胃促胰酶特异性地识别作为底物的蛋白或肽中所含的苯丙氨酸或酪氨酸这样的芳族氨基酸，切割与该氨基酸相邻的肽键。作为人胃促胰酶的代表性底物，可列举血管紧张素I(AngI)。人胃促胰酶切割AngI，产生作为血管收缩因子的血管紧张素II(AngII)。哺乳类的胃促胰酶在系统学上被分为α和β两个亚家族。包括人在内的灵长类所表达的胃促胰酶仅有一种且属于α家族。另一方面，啮齿类表达α和β两个家族的胃促胰酶。在小鼠的情况下，已知有多种胃促胰酶，根据底物特异性或在组织中的表达方式，认为属于β家族的小鼠肥大细胞蛋白酶-4(mMCP-4)最接近于人胃促胰酶。另外，即使在仓鼠中，也是属于β家族的仓鼠胃促胰酶-1与其对应。另一方面，与人胃促胰酶属于相同α家族的mMCP-5或仓鼠胃促胰酶-2具有弹性蛋白酶样活性，底物特异性不同。胃促胰酶与转化生长因子β(TGF-β)的活化密切相关。TGF-β以潜在型(潜在的TGF-β)的形式存在于上皮细胞或内皮细胞周围的细胞外基质中，经由大的潜在的TGF-β结合蛋白(LTBP)保持在细胞外基质中。根据需要，由细胞外基质中释放，活化的TGF-β参与细胞的生长分化、组织障碍后的修复或再生，对生物体而言是极其重要的细胞因子。另外，还已知其信号的破绽与各种疾病的发病和进展有关。在该过程中，认为胃促胰酶参与潜在的TGF-β由细胞外基质的游离、以及由潜在的TGF-β向活性型TGF-β的转换反应。已知胃促胰酶与纤维化(纤维症)、循环系统疾病、炎症、过敏性疾病、脏器粘连等各种疾病有关。纤维化是指在肺或心脏、肝脏、肾脏、皮肤等中发生细胞外基质的代谢异常，结缔组织蛋白过度沉积的疾病。例如，在肺纤维化中，胶原等结缔组织蛋白过度沉积于肺中，导致肺泡硬且缩小，会陷入呼吸困难。已知肺的纤维化是以暴露于大量的灰尘而引起的尘肺、因使用抗癌药等药物而引起的药物性肺炎、过敏性肺炎、肺结核、胶原病这样的自身免疫疾病等为原因而发生的。另一方面，还有不少原因不明的病例。纤维化的分子水平的发病机理尚未充分明确。通常在正常状态下成纤维细胞的生长或其功能被充分控制，但在炎症或外伤严重或持续的情况下，组织修复机制过度工作，发生成纤维细胞的异常生长或结缔组织蛋白的过度生产。作为引起这种现象的因子，已知有TGF-β。作为暗示其参与的报道，有人报道了：若对纤维化动物模型给予抗TGF-β中和抗体，则胶原表达减少，纤维化得到明显抑制。另外，在特发性肺纤维化患者中，可见TGF-β或胃促胰酶阳性肥大细胞的增加。另一方面，通过使用模型动物的实验显示了胃促胰酶与纤维化有关。在仓鼠的博来霉素诱发性肺纤维化模型中，胃促胰酶活性亢进、胶原IIImRNA的表达增加、组织纤维化这些现象因胃促胰酶抑制剂而显著减少。在小鼠的博来霉素诱发性肺纤维化模型中也同样，通过给予胃促胰酶抑制剂，可获得胃促胰酶活性抑制、羟基脯氨酸量减少这样的效果。由以上可知：胃促胰酶抑制剂可用作纤维化等与胃促胰酶有关的疾病的预防药或治疗药。作为胃促胰酶抑制剂，开发了作为低分子化合物的TPC-806或SUN-13834、SUN-C8257、SUN-C8077、JNJ-10311795等(专利文献1)。然而，近年来RNA适配体在治疗药、诊断药、试剂中的应用受到关注，几种RNA适配体已进入临床阶段或实用阶段。2004年12月作为世界上第一个RNA适配体药物的Macugen在美国被批准作为老年性黄斑变性的治疗药。RNA适配体是指特异性地与蛋白等靶物质结合的RNA，可使用SELEX法(指数富集配体系统进化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment))来制作(专利文献2～4)。SELEX法是指从1014个左右的具有不同的核苷酸序列的RNA库(RNApool)中选出特异性地与靶物质结合的RNA的方法。所使用的RNA形成了通过引物序列夹入40个核苷酸左右的随机序列的结构。使该RNA库与靶物质缔合，使用滤器等仅回收与靶物质结合的RNA。回收的RNA通过RT-PCR扩增，将其用作下一轮的模板。通过重复进行10次左右该操作，有时可获取特异性地与靶物质结合的RNA适配体。适配体药物与抗体药物同样能够以细胞外蛋白为靶，但若参考已公开发表的多篇学术论文等，则其有可能在几个方面超过抗体药物。例如，适配体往往会对靶分子显示出较抗体高的亲和性或特异性。另外，认为不易受到免疫排斥、不易发生抗体特有的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)等副作用。从递送的角度考虑，因适配体为抗体的1/10左右的分子尺寸，故容易发生组织转移，更容易将药物递送至靶位点。适配体是通过化学合成来生产的，因此可进行位点选择性的化学修饰，如果大量生产，则可谋求降低成本。此外，长期保存稳定性或热/溶剂抗性也是适配体的优越特征。另一方面，通常适配体的血中半衰期较抗体短。然而，在考虑毒性的情况下，这一点有时也会成为优点。根据以上情况，即使是以相同分子为靶的药品，适配体药物也有可能胜过抗体药物。作为与胃促胰酶结合、且抑制胃促胰酶活性的适配体，本专利技术人制造了包含X1GAUAGAN1N2UAAX2(式中，X1和X2相同或不同、且为A或G；N1和N2相同或不同、且为A、G、C、U或T)所表示的核苷酸序列的适配体(专利文献5(该序列在专利文献5中由SEQIDNO:21表示))。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利公报6500835号；专利文献2：国际公开WO91/19813号小册子；专利文献3：国际公开WO94/08050号小册子；专利文献4：国际公开WO95/07364号小册子；专利文献5：国际公开WO2010/143714号小册子。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的目的在于：提供针对胃促胰酶的适配体及其利用方法等。用于解决课题的手段为了解决上述课题，本专利技术人进行了深入研究，结果成功地制作了针对胃促胰酶的优质的适配体，其具有以下特征：序列完全不同于专利文献5所记载的胃促胰酶适配体，并且活性明显高，因此完成了本专利技术。即，本专利技术提供以下的专利技术等：[1]适配体，其是与胃促胰酶结合的适配体，该适配体包含UAACR1N1R2GGGG(式中，R1和R2为任意的一个碱基，N1为3～30个碱基)所表示的通用序列(其中，尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)。[2]适配体，其是与胃促胰酶结合的适配体，具有以下的式(1)所表示的潜在的二次结构(其中，尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)：[化学式1]这里，式(1)中的下述式(1’)所表示的部分显示茎/环部分结构，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.适配体，其是与胃促胰酶结合的适配体，该适配体包含UAACR

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171130 JP 2017-2305031.适配体，其是与胃促胰酶结合的适配体，该适配体包含UAACR1N1R2GGGG所表示的通用序列，式中，R1和R2为任意的一个碱基，N1为3～30个碱基，其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶。


2.适配体，其是与胃促胰酶结合的适配体，具有以下的式(1)所表示的潜在的二次结构，其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶：
[化学式1]



这里，式(1)中的下述式(1’)所表示的部分显示茎/环部分结构，R1和R2显示任意的一个碱基，
[化学式2]

。


3.权利要求1或2所述的适配体，其中，该适配体抑制胃促胰酶的活性。


4.权利要求1～3中任一项所述的适配体，其中，R1与R2的组合为A/U、C/G、A/C或G/U，其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶。


5.权利要求1～4中任一项所述的适配体，其中，嘧啶核苷酸中的至少一个被修饰或改变。


6.权利要求1～5中任一项所述的适配体，其中，序列UAACR1中的U和/或C被修饰或改变。


7.权利要求2～6中任一项所述的适配体，其中，(1’)部分的茎/环部分的碱基长度为3～21。


8.权利要求1～7中任一项的适配体，其中，N1或下述式(1’)所表示的茎/环部分结构的序列为UUGU、CUGG或AAUU，其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶：
[化学式3]

。


9.权利要求1或2所述的适配体，其中，该适配体包含以...

【专利技术属性】
技术研发人员：山崎聪子，野中洋介，中村义一，村口正宏，村田香，
申请(专利权)人：力博美科股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP