用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的载体和药物组合物，以及相关的治疗处理方法技术

本发明专利技术涉及基于使用人工microRNA(amiR)减少NKCC1表达的RNA干扰(RNAi)策略。特别地，本发明专利技术涉及通过使用人突触蛋白启动子驱动转基因表达来实现针对NKCC1的特异性amiR的神经元特异性表达的载体。

Carrier and pharmaceutical composition for reducing NKCC1 expression in subjects in need, and related treatment methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的载体和药物组合物，以及相关的治疗处理方法
本专利技术涉及减少有需要的受试者中NKCC1表达的载体、药物组合物和方法。
技术介绍
由SLC12A2(NKCC1)编码的Na+、K+、2Cl-协同转运蛋白(NKCC)属于阳离子氯化物协同转运蛋白(CCCs)的亚家族，其提供钠、钾和氯化物跨质膜的电中性转运。几项证据表明，NKCC1通过调节细胞内氯化物的浓度参与多种疾病的发病机制。例如，最近的研究表明，氯化物协同转运蛋白NKCC1在DS小鼠模型和唐氏综合症患者的脑中过表达(Deiddaetal.,2015；WO2015091857A1)。唐氏综合症(DS)是儿童和成人智力障碍的最常见原因。唐氏综合症是一种遗传疾患，由全部或部分的人类21号染色体的第三条拷贝的存在引起，因此也被称为21三体综合症。唐氏综合症几乎都以认知障碍、记忆力减退和学习困难为特点。因此，用NKCC1抑制剂(也是利尿的FDA批准的药物)布美他尼(Bumetanide)进行药物治疗可在DS的Ts65Dn小鼠模型中恢复突触可塑性和认知障碍(Deiddaetal.,2015；WO2015091857A1)。但是，一些数据表明需要使用布美他尼进行终生治疗，从而潜在地引起不期望的过度利尿(这会损害治疗依从性)以及许多电解质长期失衡的相关副作用。此外，布美他尼的全身性治疗也会在除大脑以外的其他器官中阻断NKCC1的活性，这可能会引起耳毒性(Ben-Arietal.,2016)。因此，有必要克服基于NKCC1活性降低的DS疗法的这些限制。
技术实现思路
本专利技术涉及减少有需要的受试者中NKCC1表达的载体、药物组合物和方法。本专利技术的范围由所附权利要求书限定。具体实施方式专利技术人已经基于使用人工microRNA(amiR)减少NKCC1表达开发了RNA干扰(RNAi)策略。通过用针对hNKCC1的反义靶向序列替换天然存在的初级microRNA(pri-miRNA)支架(scaffold)(例如小鼠microRNA155；基因库登录号：NR_029565.1)的21-22个核苷酸的反义靶向序列(所谓的引导链)来构建人工microRNA。特别地，专利技术人已设计了一种系统，该系统通过使用人突触素启动子驱动转基因表达来实现针对NKCC1的特定amiR的神经元特异性表达。因此，在第一方面，本专利技术涉及用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的治疗方法的载体，该载体包含编码能够降低NKCC1表达的amiR的多核苷酸，其中amiR包含选自由SEQIDNO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的至少一个核酸序列。本专利技术的第二方面涉及用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的治疗方法的药物组合物，该组合物包含根据本专利技术的载体。本专利技术的第三方面涉及减少有需要的受试者中NKCC1表达的方法，包括向该受试者递送治疗有效量的根据本专利技术的载体。通过下面的详细描述，本专利技术的其他特征和优点将变得显而易见。如本文所用，用于“Na-K-Cl协同转运蛋白”的NKCC表示有助于钠、钾和氯化物主动转运进出细胞的蛋白质。该膜转运蛋白有几种变体或同种型，特别是NKCC1和NKCC2。NKCC1由SLC12A2基因(基因ID6558)编码，并广泛分布于整个身体，但也分布在大脑中，且尤其是在发育中的动物和人脑中。它起到增加神经元中细胞内氯化物的作用，并从而使GABA更具兴奋性。大量研究表明，阻断NKCC1减少了细胞内的氯化物，从而增强GABA的抑制作用。示例性的人核酸和氨基酸序列分别由NCBI参考序列NM_001046.2和NP_001037.1表示。如本文所用，术语“受试者”是指人类和动物受试者两者。动物包括但不限于哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物、猴子(例如猕猴、恒河猕猴或猪尾猕猴)、犬、猫、牛、猪、禽类(例如鸡)、小鼠、兔和大鼠。在一些实施方式中，受试者典型地意指人类。在一些实施方式中，受试者患有选自由以下组成的组的疾病：唐氏综合症、脆性X综合征、雷特综合征(Rettsyndrome)、结节性硬化症、外伤性脑损伤、癫痫病、自闭症、精神分裂症、帕金森氏病、高血压。因此，本专利技术的载体特别适合于治疗上述疾病。如本文所用，术语“雷特综合征”具有其在本领域中的一般含义，并且是指X染色体连锁的神经发育障碍，其导致发育逆转，特别是在表达语言和手使用方面。临床特征包括手脚小和头部生长速度减慢，某些情况下包括小头畸形。雷特综合征与树突棘的神经病理学有关，特别是在患有雷特综合征的患者中发现了海马锥体神经元中树突棘密度的降低((ChapleauCAetal,NeurobiolDis2009,35(2):219-33)。如本文所用，术语“结节性硬化症”或“伯恩维尔氏病”具有其在本领域中的一般含义，并且是指由两个基因TSC1和TSC2中的任一个的突变引起的神经皮肤综合症，所述两个基因分别编码蛋白质错构瘤蛋白(hamartin)和结节蛋白(tuberin)，两者均起抑癌作用。结节性硬化症导致大脑和其他重要器官(诸如肾脏、心脏、眼、肺和皮肤)的非恶性肿瘤生长。在结节性硬化症患者中已经描述了不同类型的树突异常(Machado-SalasJP,ClinNeuropathol1984,3(2):52-8)。如本文所用，术语“外伤性脑损伤”或“TBI”具有其在本领域中的一般含义，并且是指由于头部的任何类型的外伤(诸如对头部的撞击或摇晃)引起的任何微观或宏观损伤、伤口或伤害。外伤性脑损伤可能是由于外在的物理力量对大脑造成的后天伤害。外伤性脑损伤的常见原因包括但不限于跌倒(例如，从床上跌落、在浴缸中滑倒、跌落台阶、从梯子上跌落以及相关的跌倒)、与车辆相关的碰撞(例如，涉及汽车、摩托车或自行车，以及涉及此类事故的行人的碰撞)、暴力(例如，枪伤、家庭暴力或虐待儿童(例如，摇晃婴儿综合症)、运动伤害(例如，发生在足球、拳击、橄榄球、棒球、长曲棍球、滑板、曲棍球和其他高冲击或极限运动中)、炸药爆炸和其他战斗伤害(例如，来自穿透性伤口、弹片或碎屑对头部的重击以及爆炸后的跌倒或与物体的身体碰撞)等等。诊断TBI的方法在本领域中是众所周知的。外伤性脑损伤还可包括由缺血性事件(例如中风)、手术、放射或其他医疗程序引起的脑外伤。如本文所用，术语“癫痫病”具有其在本领域中的一般含义，并且是指以反复无故发作为特点的慢性神经疾患。这些癫痫发作是大脑中异常、过度或同步神经元活动的短暂征兆和/或症状。有40多种不同类型的癫痫病，包括但不限于儿童期失神癫痫、青少年失神癫痫、良性罗兰氏(Rolandic)癫痫、阵挛性癫痫、复杂的部分性癫痫、额叶癫痫、高热性癫痫、婴儿痉挛、青少年肌阵挛性癫痫、兰诺克斯(Lennox-Gastaut)综合征、蓝道-克里夫纳(Landau-Kleffner)综合征、肌阵挛性癫痫、与癫痫发作相关的线粒体疾患、拉福拉病、进行性肌阵挛性癫痫、反射性癫痫和拉斯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含编码能够减少受试者中NKCC1表达的人工microRNA(amiR)的多核苷酸的载体，用于在有需要的受试者中降低NKCC1表达的治疗处理方法的用途，其特征在于，所述amiR包含选自由SEQ ID NO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的至少一种核酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170411 EP 17305434.71.一种包含编码能够减少受试者中NKCC1表达的人工microRNA(amiR)的多核苷酸的载体，用于在有需要的受试者中降低NKCC1表达的治疗处理方法的用途，其特征在于，所述amiR包含选自由SEQIDNO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的至少一种核酸序列。


2.根据权利要求1所述的用途的载体，其中，所述受试者患有选自由以下组成的组的疾病：唐氏综合症、脆性X综合征、雷特综合征、结节性硬化症、外伤性脑损伤、癫痫病、自闭症、精神分裂症、帕金森氏病和高血压。


3.根据权利要求1或2所述的用途的载体，其中，所述amiR由以下组成：源自天然miRNA的5'侧翼区域，TGCT核苷酸突出端，5'G+源自hNKCC1的选自由SEQIDNO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的短21个核苷酸反义序列，环形成序列，源自hNKCC1的2个核苷酸被除去(Δ2)以产生内部环的短19个核苷酸有义序列，CAGG突出端以及源自天然miRNA的3'侧翼区域。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途的载体，其中，所述源自天然miRNA的5'侧翼区域是SEQIDNO：90。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途的载体，其中，所述环形成序列是SEQIDNO：91。...

【专利技术属性】
技术研发人员：费代里科·明戈齐，朱塞佩·龙齐蒂，安德烈亚·孔泰斯塔比莱，劳拉·坎切达，
申请(专利权)人：国家医疗保健研究所，埃夫里大学，吉尼松公司，意大利学院科技基金会，泰莱托恩基金会，
类型：发明
国别省市：法国;FR