与CFP10特异性结合的DNA适体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及：一种与10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)特异性结合的DNA适体；一种用于诊断结核的生物传感器，其包括该DNA适体；以及一种用于提供用于诊断结核的信息的方法。本申请人已经确定，根据本发明专利技术的DNA适体具有与CFP10蛋白特异性结合的能力，并且其结合强度很强。当使用本发明专利技术的DNA适体时，可以预期优于使用现有抗体的ELISA方法的优异的稳定性，因此预期，该适体可以有效地用于开发用于诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器、用于提供用于诊断结核的信息的方法等。

DNA aptamer specifically combined with CFP10 and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与CFP10特异性结合的DNA适体及其用途
本专利技术涉及用于蛋白检测的适体，更具体地，涉及与已知在结核分枝杆菌H37Rv中表达的10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)特异性结合的DNA适体。
技术介绍
结核是由结核分枝杆菌感染导致的常见致命疾病。结核的症状包括由于厌食、高烧和伴有血痰的咳嗽引起的突然的体重减轻。诊断方法包括X射线检查、痰液涂片检查和聚合酶链反应(PCR)，最后通过它们的组合来诊断结核。众所周知，结核在包括非洲地区在内的发展中国家经常发生，最近被认为是一种已根除的疾病。但是，根据世界卫生组织的统计数据，这是一种可怕的疾病，在2015年全球死亡致因中排名前10位，尤其是，韩国在结核发病率和死亡率方面以压倒性的数量位居经合组织(OECD)国家之首。因此，韩国制定了国家结核管控指南，最大的问题是潜伏性结核的诊断，潜伏性结核患者的人数估计为20亿，相当于世界人口的三分之一。10％的潜伏性结核发展为活动性结核，在其症状发作之前进行早期诊断和治疗很重要。当前，潜伏性结核的诊断基于两种测试：结核菌素皮肤测试(TST)和干扰素-γ释放测定(IGRA)。TST至少需要48小时到72小时，并且可能会因BCG疫苗接种或感染非结核分枝杆菌而显示假阳性结果。IGRA是一种间接诊断方法，其中将患者的血液添加到附着有结核分枝杆菌特异性抗原的管中，接着刺激16小时，然后测量干扰素-γ的分泌。与TST相比，由于使用了结核分枝杆菌特异性抗原，假阳性结果的概率很低，但是考虑到结核的流行地区大多炎热或潮湿，缺乏稳定性便是一个缺点。另外，通过在血液中的刺激间接测量干扰素-γ的分泌，因此存在诸如敏感性降低之类的缺点。同时，已知CFP10在结核分枝杆菌H37Rv中过表达，这导致对人类致命的结核。目前尚不确切知道在感染期间诱发宿主疾病的机制，但推测CFP10与ESAT6形成复合物，该复合物被用作针对干扰素-γ分泌的结核分枝杆菌特异性抗原，以介导IGRA上的Th1细胞免疫应答。适体是对特定物质具有高特异性和亲和力的单链DNA(ssDNA)或RNA，由于对特定物质的亲和力非常高且稳定，近来已得到积极开发，并且其在治疗剂和诊断传感器中的应用在积极进行中(参见韩国专利登记号10-1279585)。适体可以使用相对简单的方法合成，并且可以靶向细胞、蛋白，甚至靶向小的有机物，因此有可能开发使用适体的新型检测方法，并且由于与先前开发的抗体相比，其特异性和稳定性更高，有可能将其应用于治疗剂、药物递送系统和诊断性生物传感器的开发，因此，继续对其进行研究。
技术实现思路
技术问题由于付出了巨大的努力来开发能够替代针对10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)的抗体的适体，本专利技术的专利技术人生产了对CFP10蛋白具有特异性结合能力的DNA适体，从而基于该发现完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的是提供一种与10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)特异性结合的DNA适体，其中DNA适体由SEQIDNO:6的核苷酸序列组成。本专利技术的另一个目的是提供一种用于诊断结核的组合物，其包括DNA适体。本专利技术的又一个目的是提供一种用于诊断结核的生物传感器，其包括对10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)具有特异性的DNA适体；以及其上固定有DNA适体的板，其中DNA适体由SEQIDNO:6的核苷酸序列组成。本专利技术的又一个目的是提供一种提供用于诊断结核的信息的方法，该方法包括：(1)用生物传感器处理受试者样本；以及(2)测量与生物传感器结合的10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)的水平。然而，本专利技术要解决的技术问题不限于上述技术问题，并且根据以下描述，其他未提及的技术问题对本领域普通技术人员来说将变得显而易见。技术方案根据本专利技术的一个方面，提供一种与10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)特异性结合的DNA适体，其中所述DNA适体由SEQIDNO:6的核苷酸序列组成。在本专利技术的一个实施方案中，CFP10可以在结核分枝杆菌H37Rv中表达，但是本专利技术不限于此。本专利技术还提供一种用于诊断结核的组合物，其包括所述DNA适体。本专利技术还提供一种用于诊断结核的生物传感器，其包括：对10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)具有特异性的DNA适体；以及其上固定有DNA适体的板，其中所述DNA适体由SEQIDNO:6的核苷酸序列组成。在本专利技术的一个实施方案中，所述板可以由金属电极层和金属纳米颗粒层组成，并且优选地，金属可以是金(Au)，但是本专利技术不限于此。本专利技术还提供一种提供用于诊断结核的信息的方法，所述方法包括：(1)用生物传感器处理受试者样本；以及(2)测量与所述生物传感器结合的10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)的水平。本专利技术还提供一种诊断结核的方法，所述方法包括使DNA适体与受试者样本接触。本专利技术还提供一种诊断结核的方法，所述方法包括：用生物传感器处理受试者样本；以及测量与所述生物传感器结合的CFP10的水平。在本专利技术的一个实施方案中，所述受试者样本可以是需要诊断结核的个体的血液，并且所述血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。本专利技术还提供DNA适体用于诊断结核的用途，所述DNA适体与10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)特异性结合。专利技术的有益效果根据本专利技术的DNA适体具有对10kDa培养物滤液蛋白(CFP10蛋白)的特异性结合能力，并且其结合能力优异，因此在结核的诊断中可以排除假阴性反应(false-negativeresponse)。另外，本专利技术的DNA适体与靶(CFP10)具有高亲和力，并且对除靶以外的物质具有高排他性，使得在结核的诊断中可以排除假阳性反应。与使用现有抗体的ELISA方法相比，当使用本专利技术的DNA适体时，可以预期有优异的稳定性，因此，该适体有望有效地应用于：用于开发诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器、提供用于诊断结核的信息的方法等。附图说明图1示出了通过扩增CFP10基因来确认(confirm)重组CFP10蛋白的过表达的结果(Bef泳道表示诱导过表达之前，Aft泳道表示通过用IPTG处理获得的过表达诱导结果)，以及观察通过FPLC获得的高纯度重组CFP10蛋白的结果。图2示出了确认单链DNA(ssDNA)和CFP10之间的结合程度(％)的结果以及选择过程的结果。图3示出了通过荧光测量确认适体序列的Kd值的结果。图4示出了通过电泳迁移率变动分析(EMSA)方法确认CG6和CG2适体是否与CFP10蛋白结合的结果。图5是使用DNA适体检测CFP10蛋白的生物传感器的示意图。图6a和6b示出了使用CG6适体获得的CFP10检测结果。图7示出了显示针对CFP10蛋白的结合特异性实验中的相对阻抗值根据与每种蛋白的反应而变化的结果。图8示出了显示当从正常个体和结核患者分离的血清样本用CG6适体处理时阻抗值变化的结果。具体实施方式由于付出了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)特异性结合的DNA适体，其中所述DNA适体由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170925 KR 10-2017-01233831.一种与10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)特异性结合的DNA适体，其中所述DNA适体由SEQIDNO:6的核苷酸序列组成。


2.根据权利要求1所述的DNA适体，其中所述CFP10在结核分枝杆菌H37Rv中表达。


3.一种用于诊断结核的组合物，所述组合物包括根据权利要求1所述的DNA适体。


4.一种用于诊断结核的生物传感器，所述生物传感器包括：对10kDa培养物滤液蛋白(CFP10)具有特异性的DNA适体；以及其上固定有所述DNA适体的板，其中所述DNA适体由SEQIDNO:6的核苷酸序列组成。


5.根据权利要求4所述的生物传感器，其中所述板由金属电极层和金属纳米颗粒层组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：金润根，潘沧一，张哲熏，
申请(专利权)人：MD奥图斯公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR