干扰IL-6表达的CD19-CAR-T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了两种干扰人IL‑6基因表达的shRNA，如SEQ ID NO:1、2所示。本发明专利技术还公开了一种慢病毒表达载体，其包含有干扰人IL‑6基因表达的shRNA，以及如SEQ ID NO:4所示的编码嵌合抗原受体的核苷酸片段。本发明专利技术还公开了一种干扰人IL‑6基因表达的CD19‑CAR‑T细胞，为包含有慢病毒表达载体的T淋巴细胞，或染色体中整合有干扰人IL‑6基因表达的shRNA，以及编码嵌合抗原受体的核苷酸片段的T淋巴细胞。本发明专利技术的CAR‑T细胞引入了IL‑6 shRNA，在表达CAR的同时共表达IL‑6的shRNA，通过基因沉默技术从源头抑制IL‑6的释放，从而降低CRS的影响，提高CAR‑T治疗的安全性。可以预计，在制备预防、治疗、辅助治疗恶性肿瘤的药物中将有着重要的应用。

CD19-CAR-T cells interfering with IL-6 expression and their application

The invention discloses two kinds of shRNA interfering with human IL 6 6 gene expression, such as SEQ ID NO:1 and 2. The present invention also discloses a lentivirus expression vector which contains shRNA interfering with the expression of human IL 6 gene and nucleotide fragments encoding chimeric antigen receptors as shown in SEQ ID NO:4. The present invention also discloses a CD19 CAR T cell interfering with the expression of human IL_6 gene, which is a T lymphocyte containing a lentivirus expression vector, or a T lymphocyte integrating shRNA interfering with the expression of human IL_6 gene in chromosome, and a nucleotide fragment encoding a chimeric antigen receptor. The CAR T cells of the present invention introduce IL 6 shRNA, co-express IL 6 shRNA while expressing CAR, and inhibit the release of IL 6 from the source by gene silencing technology, thereby reducing the impact of CRS and improving the safety of CAR T treatment. It can be predicted that there will be important applications in the preparation of drugs for the prevention, treatment and adjuvant treatment of malignant tumors.

【技术实现步骤摘要】
干扰IL-6表达的CD19-CAR-T细胞及其应用
本专利技术涉及干扰IL-6表达的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorTcell，CAR-T)的制备及其应用，属于基因工程和细胞生物学领域。
技术介绍
1989年，嵌合抗原受体改造T细胞(CAR-T)这一概念被首次提出，目的是建立肿瘤特异性识别能力的过继细胞疗法。第一代CAR的设计是简单的用特异性单克隆抗体来源的scFv(single-chainantibodyvariableregionfragment)段替换TCR(Tcellreceptor)的胞外区部分，保留了跨膜结构和胞内传递信号的CD3ζ区域，有的研究组胞内信号传递部分也会采用FcR。但第一代CAR的临床试验结果却非常令人失望，效果最好的一次临床试验也仅仅有2/11个病人有长期的缓解。随着对免疫学认识的不断深入，人们发现CD3ζ信号虽然能够诱导T细胞的活化和短暂增殖，但之后会诱导T细胞的无能(anergy)。1998年，有两个实验室报道了CD28信号结构域可以为CD3ζ信号提供辅助的共刺激功能。因此，第二代CAR的设计在第一代的基础上引入了共刺激分子的部分，如CD28或CD137(4-1BB)的胞内信号结构域。而第三代CAR则是加入了2个共刺激分子的功能信号结构域，包括CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40(15-18)。现在在临床上进行实验的主要是第二代CAR的设计。CAR-T的疗效已经被业内所公认，2017年8月30日，美国FDA批准了首个CAR-T药物——Kymriah(tisagenlecleucel)，用于治疗复发或难治性(r/r)儿童和年轻成人B细胞急性淋巴细胞白血病。这是首个获批的免疫细胞药物。一个多月后的10月18日，FDA批准Kite制药Yescarta(axicabtageneciloleucel，KTE-C10)，用于治疗对其他疗法无响应或者接受过至少2种治疗方案后复发的特定类型成人大B细胞淋巴瘤患者,包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤。Yescarta是FDA批准的第2款CAR-T疗法。与CD-19-CAR-T疗法的有效性共存的是它的副作用和细胞毒性。由于设计时选取CD19为靶点，输入的T细胞会将体内本身存在的正常B细胞与肿瘤细胞一起杀掉，并且在肿瘤消失后，只要CAR-T细胞依然存在，机体内都不会有正常B细胞存活，病人需要间隔一定时间注射免疫球蛋白以维持基本的体液免疫。另一方面，在CAR-T细胞输入初期，由于T细胞的大量扩增以及T细胞杀伤肿瘤过程中会分泌大量细胞因子，病人会出现细胞因子释放综合症(CytokineReleaseSyndrome，CRS)，具体表现为发热、低血压、缺氧以及血清中某些细胞因子水平显着升高，这些因子包括干扰素-γ(IFN-γ)，分形趋化因子(Fracktalkine)，粒-巨噬细胞生长因子(GM-CSF)，白细胞介素-5(IL-5)，白细胞介素-6(IL-6)，人FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)和白细胞介素-10(IL-10)。2016年7月初，总部位于西雅图的JunoTherapeutics发布了报道在该公司进行的临床试验JCAR015中，先后有三位病人(后被证实是四位)在接受CAR-T细胞治疗后发生死亡，FDA随即停止了JCAR015的临床试验，Juno随后解释是因为使用化疗药物氟达拉滨导致神经毒素，但也有很多人猜测是由于输入的T细胞所产生的强烈细胞因子风暴(CRS)导致病人死亡。瑞士著名的诺华(Novartis)公司的靶向CD-19的产品CLT019虽然能够让80％的患者病情得到缓解，但同时也会导致近一半的患者出现细胞激素释放症(CRS)。出现CRS的患者体内，T细胞会释放过多的炎症因子，导致过激的炎症反应和发烧，严重的话会危及生命。同样的，美国加州的KitePharma公司用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的产品KTE-C19，会导致1/3的患者出现神经系统副作用、1/5的患者出现CRS，还有两名患者在测试中死亡。通常来说，采用大剂量类固醇激素，如强的松，可以迅速逆转CRS的临床症状。但是，类固醇药物会显著抑制CAR-T细胞在体内的增殖，使得患者有较高的复发率，影响CAR-T治疗的疗效。现在临床上处理CRS较好的治疗药物是白细胞介素-6受体(IL-6R)的阻断性单克隆抗体药物(Tocilizumab)。已有临床试验证明，阻断IL-6受体后能迅速解决CRS带来的毒副作用并且对CAR-T细胞体内增殖没有影响。目前FDA已正式批准Tocilizumab用于治疗CAR-T疗法中可能会出现的CRS风险。但是Tocilizumab价格昂贵，对患者来说是不小的经济负担，因此，如果能够从源头上切断IL-6细胞因子的释放，就能很大程度上减轻CRS的风险，增强CAR-T治疗的安全性。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种普遍存在于生物体内、序列特异性强、转录后水平的基因沉默机制。目前，应用较为普遍的发挥干扰作用的小RNA分子在动物体内主要有siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)和amiRNA(artificialmicroRNA)等。最早采用RNAi技术研究生物体内基因功能的方法是将体外制备好的单链siRNA分子直接注入线虫体内，虽然后来在基因功能研究中被沿用，但是这种方法的干扰时效性相对较短，为达到有效干扰而提高siRNA的浓度又往往有细胞毒性。现在的RNAi技术采用的方法多为构建一个特定的RNAi表达载体，该载体导入动植物细胞后能由RNA聚合酶Ⅱ型或Ⅲ型启动子转录出相应的shRNA，amiRNA等，进而干扰其靶基因的表达。目前，普遍用于构建shRNA干扰表达载体的方法主要有以下两种：(1)寡核苷酸退火法，普遍做法是化学合成两条特定的寡核苷酸引物，在离体条件下退火形成两端带有黏性末端的双链shRNA片段，然后与经过酶切处理同样带有黏性末端的载体连接转化，得到含有shRNA感染表达单元的重组质粒。(2)PCR扩增法：设计一对扩增控制shRNA表达启动子的PCR引物，其中正向引物与启动子特异性匹配，反向引物5’末端额外加上针对目的基因的干扰靶序列，将PCR产物克隆到相应的载体上，得到shRNA干扰表达载体。白细胞介素-6(IL-6)作为细胞因子释放综合症(CytokineReleaseSyndrome，CRS)中发挥重要作用的细胞因子，设计针对IL-6的shRNA，通过基因沉默技术从源头抑制白细胞介素-6(IL-6)的释放，从而降低CRS的影响，是提高CAR-T安全性，降低毒副作用的有益思路。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，成功筛选出了2种能够干扰IL-6基因表达的shRNA，并将该shRNA和CD19CAR共表达。本专利技术的专利技术人发现，共表达了干扰IL-6基因表达的shRNA的CD19CAR-T细胞，杀伤表达CD19的肿瘤细胞的过程中IL-6、IFN-gama等因子的释放量降低，从而在源头上降低了CRS的影响，提高CAR-T治疗中的安全性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.干扰人IL‑6基因表达的shRNA，其特征在于：为IL‑6 shRNA‑1，或IL‑6 shRNA‑2，IL‑6 shRNA‑1的核苷酸序列如下所示，IL‑6 shRNA‑2的核苷酸序列如下所示：IL‑6 shRNA‑1，如SEQ ID NO:1所示：GCGGCCGCCCTGGATTCAATGAGGAGACTTTTCAAGAGAAAGTCTCCTCATTGAATCCAGTTTT；IL‑6 shRNA‑2，如SEQ ID NO:2所示：GCGGCCGCCCAGAACGAATTGACAAACAAATTCAAGAGATTTGTTTGTCAATTCGTTCTGTTTTT。

【技术特征摘要】
1.干扰人IL-6基因表达的shRNA，其特征在于：为IL-6shRNA-1，或IL-6shRNA-2，IL-6shRNA-1的核苷酸序列如下所示，IL-6shRNA-2的核苷酸序列如下所示：IL-6shRNA-1，如SEQIDNO:1所示：GCGGCCGCCCTGGATTCAATGAGGAGACTTTTCAAGAGAAAGTCTCCTCATTGAATCCAGTTTT；IL-6shRNA-2，如SEQIDNO:2所示：GCGGCCGCCCAGAACGAATTGACAAACAAATTCAAGAGATTTGTTTGTCAATTCGTTCTGTTTTT。2.用于制备权利要求1所述的干扰人IL-6基因表达的shRNA的引物，其特征在于：用于制备IL-6shRNA-1的引物，其核苷酸序列如下所示：hIL-6-shRNA1-1st：GGCCGCCCTGGATTCAATGAGGAGACTTTTCAAGAGA；hIL-6-shRNA1-2nd：AAGTCTCCTCATTGAATCCAGTTTTTGC；hIL-6-shRNA1-3rd：AAGTCTCCTCATTGAATCCAGGGC；hIL-6-shRNA1-4th：GGCCGCAAAAACTGGATTCAATGAGGAGACTTTCTCTTGAA；用于制备上IL-6shRNA-2的引物，其核苷酸序列如下所示：hIL-6-shRNA2-1st：GGCCGCCCAGAACGAATTGACAAACAAATTCAAGAGA；hIL-6-shRNA2-2nd：TTTGTTTGTCAATTCGTTCTGTTTTTGC；hIL-6-shRNA2-3rd：TTTGTTTGTCAATTCGTTCTGGGC；hIL-6-shRNA2-4th：GGCCGCAAAAACAGAACGAATT...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭毅，郭红，张慧慧，
申请(专利权)人：山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37