基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法。本发明专利技术提供了敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法，质粒转染SK‑N‑SH细胞后，制备单克隆，Cruiser

Construction method of human neuroblastoma cell line knockout CAPNS1 gene based on CRISPR/Cas Technology

The invention relates to the field of genetic engineering technology, in particular to a method for constructing a human neuroblastoma cell line that knocks out CAPNS1 gene based on RISPR/Cas technology. The present invention provides a method for knocking out CAPNS1 gene in human neuroblastoma cells. After plasmid transfection into SK N SH cells, monoclonal, cruiser are prepared.

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法。
技术介绍
钙蛋白酶(calpain)是一组高度保守的特异性Ca2+依赖性细胞内中性蛋白酶，其活性主要与细胞内Ca2+浓度有关。calpain在机体的生理过程中发挥着重要作用，其不仅与细胞内蛋白质的水解关，还参与细胞自噬、细胞周期调控与凋亡、细胞骨架重构、葡萄糖转运、细胞信号转导等正常的生理过程[3,4]。自在大鼠的脑组织中首次发现一种可溶的Ca2+依赖的中性蛋白酶以来，研究者们越来越关注这种蛋白酶在体内的作用。目前，研究发现在哺乳动物中calpain存在15种亚型，其中，calpain1(μ-calpain)和calpain2(m-calpain)在体内广泛表达，且研究也较为广泛。Calpain1和calpain2主要由80kD的大亚基和30kD的小亚基(calpain-s1，CAPNS1)组成，CAPNS1是calpain1和calpain2活性所必需的，而且也是细胞迁移，凋亡和存活所必需的。人神经母细胞瘤细胞(humanneuroblastomacell,HNC)是研究神经系统基因功能和神经毒性机制的良好的体外模型，建立敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞模型有利于对CAPNS1蛋白的作用的进一步研究，更有利于对神经系统多种疾病机理的研究。基因敲除是通过DNA序列改变，出现基因功能的“全或无”表象。基因沉默技术是以不改变DNA序列为前提，使基因沉默，即基因不表达或低表达。基因编辑技术是指在基因组水平精确地进行基因编辑，其是通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的敲除、加入等过程。基因敲除构建出的突变型细胞系比基因沉默构建的细胞系稳定。细胞基因沉默的效率并不总是非常高，也不十分稳定，影响实验结果敏感性和可靠性。继锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)基因编辑技术之后，第三代基因编辑技术CRISPR/Cas技术是目前运用最为广泛的基因技术。CRISPR/Cas是一种来源于原核生物适应性免疫系统，通过人工改良而得。相比ZFN和TALENs，CRISPR/Cas技术具有成本低、可同时进行多位点编辑、效率高等优势。CRISPR/Cas系统分为3种，其中II型最为简单，研究得也较多。该系统主要包含非特异性Cas9核酸酶和sgRNA两部分，其中sgRNA具引导和检测作用；Cas9是一种RNA依赖的DNA内切核酸酶，其利用单一向导RNA(sgRNA)使双链DNA断裂，起到剪刀作用。脱靶效应是存在于所有基因组靶向修饰技术中的一道难题，它会对基因组非特性序列进行切割，造成未知突变，增加后期的鉴定工作量。CRISPR/Cas9系统中，对靶序列的识别主要是依靠一段20bp的短RNA，但是研究表明当存在单个甚至多达5个碱基错配时，切割仍能正常发生。进一步研究发现，在这20bp中只有位于PAM位点前12bp的种子序列对靶位点识别影响较大，即总共只有14bp(PAM中的GG和种子序列)是靶位点识别的关键序列。这在生物体庞大的基因组中很容易出现脱靶位点，从而引入意外突变。除此之外，Cas9蛋白或sgRNA的浓度也对脱靶活性产生影响。而神经细胞本身较其他细胞的培养较为苛刻，是一种转染质粒较难的细胞系，且转染效率低，而电转对神经细胞的伤害也较大，因此，对于转染条件的摸索较不易。在筛选单克隆时，神经细胞生长培养较难。综上，构建敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因并不容易。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于以CRISPR/Cas技术敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法及细胞系，其能够成功、稳定的敲除掉人神经母细胞瘤细胞中的CAPNS1基因。本专利技术提供了人CAPNS1基因第4外显子和/或第5外显子在构建CAPNS1基因敲除人神经母细胞瘤细胞中的应用。本专利技术还提供了靶向CAPNS1基因第4外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。靶向CAPNS1基因第5外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术试验表明，采用CAPNS1基因的第1～3外显子区域的靶位点构建出来的载体在转染细胞后，没有筛选到纯合子。而采用CAPNS1基因的第4～5外显子的CDS区作为靶点，成功地构建了CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞株。本专利技术还提供了如SEQIDNO.4～9所示的核苷酸序列的6条敲除CAPNS1基因的靶标寡核苷酸序列。所述SEQIDNO.4～9的核苷酸序列中，SEQIDNO.4～5以SEQIDNO.1为靶序列。SEQIDNO.6～7以SEQIDNO.2为靶序列。SEQIDNO.8～9以SEQIDNO.3为靶序列。本专利技术还提供了敲除CAPNS1基因的载体，包括骨架载体和dsDNA片段；所述dsDNA片段由SEQIDNO.4～5退火形成；或由SEQIDNO.6～7退火形成；或由SEQIDNO.8～9退火形成。本专利技术中，所述骨架载体为pGK1.1。所述敲除CAPNS1基因的载体的制备方法为，将dsDNA与线性化的骨架载体T4DNALigase酶连接。本专利技术还提供了敲除CAPNS1基因的试剂，包括本专利技术提供的靶标寡核苷酸序列或本专利技术提供的敲除载体。本专利技术还提供了一种敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法，将本专利技术提供的敲除载体转染入人神经母细胞瘤细胞中，获得敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞株。本专利技术中，所述人神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。所述SK-N-SH细胞为对数期的SK-N-SH细胞。本专利技术中，所述转染采用电转染，转染的电压为1400V。转染中，所述载体的浓度不低于1μg/μL。以本专利技术提供方法构建的敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞。本专利技术提供了敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法，质粒转染SK-N-SH细胞后，制备单克隆，CruiserTMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆，单克隆测序结果显示SK-N-SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功；并且，在CAPNS1-/-组，CAPNS1蛋白及Calpain1和Calpain2蛋白水平明显降低。结果表明SK-N-SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功。附图说明图1Pgk1.1质粒图谱；图2载体酶切后的电泳检测图；其中泳道1是原质粒对照，M为marker，2-4为切开的载体图3菌落PCR检测电泳图；M为Marke菌落PCR检测电泳图k；1、2为CAPNS1-gRNA1菌落PCR检测电泳图；3、4为CAPNS1-gRNA2菌落PCR检测电泳图；5、6为CAPNS1-gRNA3菌落PCR检测电泳图图4sgRNA测序验证；A、B、C分别代表插入PGK1.1载体的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3序列测序图；图5sgRNA测序比对结果；A、B、C分别表示sgRNA1位点、sgRNA2位点、sgRNA3位点比对结果；图6CAPNS1基因Cruiser验证；图7SK-N-SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人CAPNS1基因CDS区第4外显子和/或第5外显子在构建CAPNS1基因敲除的人神经母细胞瘤细胞中的应用。

【技术特征摘要】
1.人CAPNS1基因CDS区第4外显子和/或第5外显子在构建CAPNS1基因敲除的人神经母细胞瘤细胞中的应用。2.靶向CAPNS1基因第4外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。3.靶向CAPNS1基因第5外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.如SEQIDNO.4～9所示的核苷酸序列的6条敲除CAPNS1基因的靶标寡核苷酸序列。5.敲除CAPNS1基因的载体，其特征在于，包括骨架载体和dsDNA片段；所述dsDNA片段由SEQIDNO.4～5退火形成；或由SEQIDNO.6～7退火形成；...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙鼎新，朱家佳，李小玲，杨越，唐乖，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43