本发明专利技术提供了一种采用CRISPR‑cas系统针对表皮干细胞进行GINS2基因编辑，特别是涉及一种构建GINS2基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。其中构建并获得了两个特异的gRNA，能够显著提高表皮干细胞内CRISPR/Cas9针对GINS2的基因编辑效率。本发明专利技术提供的表皮干细胞GINS2敲除质粒具有较好的遗传稳定性以及较高的打靶效率。
GING2 gene knockout in epidermal stem cells using CRISPR-Cas system
The invention provides a CRISPR_cas system for GINS2 gene editing of epidermal stem cells, in particular to the establishment of a cell line for constructing GINS2 gene knockout epidermal stem cells. Two specific gRNA were constructed and obtained, which could significantly improve the editing efficiency of CRISPR / Cas9 for GINS2 in epidermal stem cells. The knockout plasmid of epidermal stem cell GINS2 provided by the invention has good genetic stability and high shooting efficiency.
【技术实现步骤摘要】
表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行GING2基因敲除
本专利技术提供一种采用CRISPR-cas系统针对表皮干细胞进行GING2基因编辑，特别是涉及一种构建GING2基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。
技术介绍
表皮干细胞(Epidermalstemcells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transitamplifyingcellsTA细胞)，TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(Post-mitoticcells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(Dunnwaldetal，ExpDermatol，2001，10：45-54.Papinietal.stemcells，2003，21：481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[Liangetal，stemcells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。人类多能干细胞(Humanpluripotentstemcells,hPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins9,CRISPR/Cas9)技术的飞速发展。GINS2是DNA复制复合体GINS家族成员之一，位于人染色体16q24上，其mRNA长度为1196bp，编码相对分子质量为21000的蛋白质。GINS是一种复制解旋酶，在移动到复制叉前打开DNA双链。研究表明，GINS家族成员在癌症的发生中起一定作用，如GINS家族成员在侵袭性黑色素瘤中过表达，也有文献表明，DNA复制相关蛋白在不同细胞中有不同的作用，如在决定中心体复制数量和疾病发生的不同阶段方面，GINS均发挥了一定功能，特别是与染色体的分离密切相关。而目前关于GINS2在肿瘤相关领域的报道很少。在CN106620703A中，针对人GINS2基因的小分子干扰RNA序列，RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒，进一步检测了GINS2基因的沉默效率、GINS2-siRNA慢病毒对肿瘤细胞增殖能力和凋亡水平的影响，结果显示采用RNAi方法下调人GINS2基因的表达后可有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长并促进其凋亡，表明GINS2基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点，通过RNAi方式沉默GINS2基因的表达可作为抑制肿瘤发展的有效手段。但是在该研究中，采用的是SiRNA进行干扰，所述方法具有敲除不彻底，不能稳定的敲除遗传的缺陷。在(IntegrationofGenomic,Biologic,andChemicalApproachestoTargetp53LossandGain-of-FunctioninTripleNegativeBreastCancer)中，虽然提到了CRISPR/Cas可以用于MCM2，GINS2，C19orf43，ELOVL2，ARL4D，DNM3OS，FGFR2，IFIT2，MPPED2，B2M，ERRFI1，GLULCASP4，CPED1，SPTLC2，CMTM6，CFH，CARS2，SUMF1，但是只是一个构想，并没有实施。针对不同的基因进行CRISPR修饰并非简单容易设计的，需要克服众多障碍，具有极大地实验困难。基于表皮干细胞的多能性，为了研究敲除GINS2基因的表皮干细胞在癌症治疗方面的功能，建立敲除GINS2基因的表皮干细胞细胞系变得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种敲除GINS2基因的表皮干细胞，有效克服了现有技术使用siRNA进行干扰不能稳定遗传的技术缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供一种CRISPR-cas系统的靶标，根据GINS2的基因序列，设计的具体的sgRNA如下：GINS2-sgRNA7：5’to3’aatgcccagcccttactacaGINS2-sgRNA23：5’to3’tgcatggaagccatcacact。为实现上述目的，本专利技术提供一种提高CRISPR-cas系统在表皮干细胞中敲除GINS2基因的方法，包括向宿主细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白ESCS-higher是由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质。进一步地，所述增效蛋白包含a)或b)：a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质的多核苷酸序列；b)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。更进一步地，提供一种在表皮干细胞中采用CRISPR/Cas9进行基因编辑的系统，其特征在于所述系统包括：(1)用于表达SEQIDNO：1所述的ESCS-higher的质粒；(2)sgRNA已经插入的表达PX330的质粒(其可以表达sgRNA和cas9)。更进一步地，所述sgRNA和cas9表达载体也可以是本领域常用的其他表达载体。本专利技术提供了一种在表皮干细胞中采用CRISPR/Cas9基因编辑GINS2的方法，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了通过近百次的gRNA设计与优化，获得了在表皮干细胞中能够特异性的针对GINS2基因进行敲除的2个特意性的gRNA，具有较强的敲除效果，而且本专利技术在表皮干细胞中，构建了GINS2基因敲除的细胞系，筛选并优化获得了最佳的sgRNA，敲除效率高，传代稳定。附图说明图1Western-blot检测GINS2蛋白表达结果图；4为表皮干细胞空白对照；3为未导入增效蛋白的gRNA7的效果；2为导入增效蛋白的gRNA7的效果；1为导入增效蛋白的gRNA23的效果。下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。具体实施方式下面通过具体实施例进一步说明本专利技术提高基因组编辑效率的方法的技术方案。实施例1、CRISPR表达载体的构建gRNA的设计根据靶基因的基因序列，通过申请人前期从几十个gRNA中优化设计具体筛选得到具体的sgRNA的形式如下：GINS2-sgRNA7：5’to3’aatgcccagcccttactacaGINS2-sgRNA23：5’to3’tgcatggaagccatcacact。根据上述的gRNA，在其5'端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN反向：NN本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种sgRNA，其用于基因编辑。
【技术特征摘要】
1.一种sgRNA，其用于基因编辑。2.一种sgRNA，其序列如SEQIDNO：3或4任一所示。3.一种提高CRISPR-cas系统在离体的表皮干细胞中敲除GINS2基因的方法，包括向宿主细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白ESCS-higher是由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质；所述sgRNA，其序列如SEQIDNO：3或4任一所示。4.如权利要求3所述的方法，进一步地，所述增效蛋白包含a)或b)：a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质；b)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨骏，朱成光，
申请(专利权)人：洛阳轩智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41
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