本发明专利技术公开一种转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用，属于基因工程和细胞工程技术领域。本发明专利技术以转录因子CEBPα为研究对象，采用了生物信息学预测Kiss1启动子区潜在结合的转录因子CEBPα，研究该转录因子CEBPα在卵巢颗粒细胞中对Kiss1启动子区活性的影响，来达到该基因在卵巢颗粒细胞中的表达调控研究。本发明专利技术首次证实通过在猪卵巢颗粒细胞中转录因子CEBPα对Kiss1基因的表达调控和在卵巢颗粒细胞中的功能进行研究。本研究实验内容丰富，结果齐全、准确。
Application of transcription factor CEBP alpha as transcription factor in Kiss1 promoter region
The invention discloses an application of transcription factor CEBPalpha as a transcription factor of Kiss1 promoter region, belonging to the field of genetic engineering and cell engineering technology. The present invention takes the transcription factor CEBPalpha as the research object, uses bioinformatics to predict the potential binding transcription factor CEBPalpha in the Kiss1 promoter region, and studies the effect of the transcription factor CEBPalpha on the activity of the Kiss1 promoter region in ovarian granulosa cells, so as to achieve the regulation of the gene expression in ovarian granulosa cells. The present invention is the first to confirm the function of transcription factor CEBP * in the regulation of Kiss1 gene expression and its function in ovarian granulosa cells by porcine granulosa cells. The results of this study are abundant and the results are complete and accurate.
【技术实现步骤摘要】
转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用
本专利技术属于基因工程和细胞工程
，具体涉及母猪卵巢卵泡发育过程中，转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。
技术介绍
卵巢卵泡的生长发育状态直接决定了母猪繁殖性能的高低，颗粒细胞功能影响着卵泡的生长与闭锁，研究发现，Kiss1在卵巢组织中可以促进卵泡的发育，影响颗粒细胞的功能。卵巢是雌性动物的生殖器官，可以为雌性动物提供性激素，为卵子的成熟提供场所，研究表明，下丘脑-垂体-性腺轴分泌的FSH和LH可以作用于卵巢，促进卵巢卵泡和卵母细胞的发育，FSH能够促进卵巢的生长，增加卵巢的质量，LH能够促进卵泡和卵母细胞的发育，促进排卵；两者还能促进卵巢分泌孕酮和雌二醇，从而促使卵巢周期性排卵，通过负反馈调节抑制GnRH、FSH和LH的释放，使GnRH、FSH和LH随着卵巢内雌激素的水平变化而呈现周期性的变化，从而维持和调节生殖发育。而在卵巢卵泡的发育过程中，扁平状的卵巢颗粒细胞会变成逐渐立方形，标志着原始卵泡开始发育为初级卵泡，随着卵巢颗粒细胞的层数的增多，颗粒细胞开始分化，这些变化在原始卵泡的休眠与激活，卵子的成熟，卵泡的闭锁，卵母细胞的生长等过程中都起着重要的作用。研究发现，Kiss1的等位基因突变，大鼠的卵泡数量明显减少，卵巢卵泡发育减慢，在卵巢卵泡发育的晚期，随着雌激素的增加，在猪和羊的下丘脑检测到Kiss1的mRNA也随之增加，但是早于GnRH的增加，有关小鼠的研究表明，kisspeptin可能直接作用于卵巢，参与卵巢早衰的形成，研究发现，Kiss1的突变或缺失可以导致人类或者小鼠出现低促性腺激素性性腺功能衰退，具体表现为雌性小鼠卵巢体积很小，卵泡发育不正常，雄性小鼠睾丸小，精子发育不良。CEBPs(CCAATenhancer-bindingproteins，CEBPs)是一类转录因子家族CCAAT增强子结合蛋白，可以特异性结合到DNA的增强子区域，广泛参与到细胞的增殖、胚胎发育、机体能量代谢、细胞凋亡和免疫反应等，其由CEBPα、CEBPβ、CEBPγ、CEBPδ、CEBPε和CEBPζ六个成员组成。当CEBPs作为负调节因子发挥作用的时候，必须存在以下三个功能区，一、稳定区(SR)，位于N末端，使蛋白结构更加稳定；二、激活区(AD)，有AD1和AD2两个区域，彼此相互独立，相互促进；三、位于C末端的DNA结一、稳定区(SR)，位于N末端，使蛋白结构更加稳定；二、激活区(AD)，有AD1和AD2两个区域，彼此相互独立，相互促进；三、位于C末端的DNA结合区，含有bZIL蛋白结构，这个结构域可以与亮氨酸拉链区紧密相连，可以特异性的结合DNA序列，含有N-末端含有酸性激活区，可以直接与DNA结合，也可以识别顺式作用元件。CEBPα对主要通过两种方式调控基因的表达：激活抑制基因的转录，在细胞的信号传导、细胞分化、细胞增殖、应激反应、能量代谢及肿瘤生成等方面发挥着很重要的作用。研究表明，敲除小鼠的CEBPα基因，小鼠的肺和肝的细胞都不能正常增殖，CEBPα突变小鼠显示骨髓前导子增加，小鼠肾脏或骨髓B细胞CEBPα或者CEBPβ的表达导致一些B细胞重编程为骨髓家系。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。本专利技术的另一目的在于提供所述的转录因子CEBPα在抑制Kiss1基因表达中的应用。本专利技术的另一目的在于提供所述的转录因子CEBPα在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。本专利技术的另一目的在于提供抑制转录因子CEBPα的RNA小干扰片段(siRNA)。本专利技术的再一目的在于提供转录因子CEBPα通过调控Kiss1影响E2的生成的应用。通过基因工程技术构建该转录因子CEBPα的超表达载体和干扰RNA，分析该转录因子CEBPα的超表达和干扰效果，研究该转录因子CEBPα在卵巢颗粒细胞中对E2的生成的影响，进而研究该转录因子CEBPα通过调控Kiss1影响E2的生成的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。本专利技术提供所述的转录因子CEBPα在抑制Kiss1表达中的应用。过表达转录因子CEBPα可抑制Kiss1的表达，干扰转录因子CEBPα的表达后促进Kiss1的表达。本专利技术提供所述的转录因子CEBPα在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。过表达转录因子CEBPα后会抑制E2的生成，干扰转录因子CEBPα的表达后能促进E2的生成。本专利技术提供所述的转录因子CEBPα通过调控Kiss1影响E2的生成的应用。过表达转录因子CEBPα后会抑制Kiss1对E2生成的促进作用，干扰转录因子CEBPα的表达后能促进Kiss1对E2生成的促进作用。本专利技术提供抑制转录因子CEBPα的siRNA，序列如下：CEBPα-siRNA-1：5′-ACGAGACGUCCAUCGACAU-3′；CEBPα-siRNA-2：5′-UCGACAUCAGCGCCUACAU-3′；CEBPα-siRNA-3：5′-CCUUCAACGACGAGUUCCU-3′；本专利技术的验证结果如下：1、生物信息学软件预测猪Kiss1启动子区存在转录因子CEBPα(GeneID:397307)的结合位点，阅读文献查阅转录因子CEBPα在卵巢卵泡发育过程中的作用，初步确定转录因子CEBPα为猪Kiss1启动子区的转录因子。2、ChIP分别验证Kiss1启动子区与潜在的转录因子CEBPα的结合情况，结果显示，转录因子CEBPα能够结合在Kiss1的启动子-744～-733区域。3、构建含有转录因子CEBPα的CDs区的真核表达载体pcDNA3.1-CEBPα，超表达转录因子CEBPα找出最适转染的浓度，为200ng。4、通过双荧光素酶报告分析，得出超表达转录因子CEBPα后，Kiss1的启动子活性降低，采用qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证得出：超表达转录因子CEBPα后，Kiss1的mRNA和蛋白水平表达显著降低。5、合成3对转录因子CEBPα干扰小片段/对照(CEBPα-siRNA/Scrambled-siRNA)，筛选并检测其干扰效率。转染基因干扰小片段到卵巢颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的CEBPα-siRNA小片段进行后续实验。6、转录因子CEBPα干扰小片段(CEBPα-siRNA)转染颗粒细胞，采用qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证得出：干扰转录因子CEBPα的表达后，Kiss1的mRNA和蛋白水平表达显著升高。7、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰转录因子CEBPα，用ELISA检测卵巢颗粒细胞上清中E2的含量。8、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰转录因子CEBPα和Kiss1，用ELISA检测卵巢颗粒细胞上清中E2的含量。本专利技术以转录因子CEBPα为研究对象，采用了分子与细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1的表达调控及功能影响。关键点在于：(1)ChIP验证转录因子CEBPα可以结合Kiss1启动子区；(2)qR本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。
【技术特征摘要】
1.转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。2.转录因子CEBPα在抑制Kiss1表达中的应用。3.转录因子CEBPα在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。4.转录因子CEBPα通过调控Kiss1影响E2的生成的应用。5.抑制转录因子CEBPα的siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列如下：CEBPα-siRNA-1：5′-ACGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛晓萍，袁晓龙，李加琪，张哲，何颖婷，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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