本发明专利技术公开了一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了该斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。并进一步公开了包含该斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的表达载体，一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法及该方法获得的重组蛋白，以及该重组蛋白在制备具有促进摄食功效的鱼类促食剂和鱼类饲料添加剂中的应用。
A food control related gene AgRP1 of Epinephelus Epinephelus and its application
The invention discloses a feeding regulation related gene AgRP1 of grouper, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1. The coding protein of the feeding regulation related gene AgRP1 was also disclosed, and its amino acid sequence was shown as SEQ ID NO:2. The expression vectors containing the feeding regulation related gene AgRP1, a preparation method of the recombinant protein of the feeding regulation related gene AgRP1 and the recombinant protein obtained by the method, and the preparation of the recombinant protein with feeding promotion effect for fish and fish feed additives are further disclosed. Application of the agent.
【技术实现步骤摘要】
一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其应用。
技术介绍
刺鼠相关蛋白(Agouti-relatedprotein，AGRP)是由AgRP基因所编码，由下丘脑AgRP/NPY神经元产生的一种旁信号分子，又称之为刺鼠相关肽。AGRP与NPY在同一类神经元中共表达，起到了增加食欲、减少新陈代谢和能量消耗的作用。同时，AGRP是一种强效和长效的食欲刺激物质，在小鼠中单次注射后促进摄食的效应时间能达到7天以上。人和大鼠的AGRP均由132个氨基酸构成，而且具有非常高的保守型(81％)。研究结果显示AGRP的二级结构主要由自由螺旋和β-片层构成，其对于受热变性和酸降解具有很高的稳定性。核磁共振(NuclearMagneticResonance，NMR)研究结果显示，AGRP末端结构由多个保守的半胱氨酸残基组成的5对二硫键维系，多个研究显示该结构是其发挥生理功能的重要区域。AgRP基因主要在下丘脑和肾上腺高表达，在性腺、肾脏和肺低表达，储存在细胞内的分泌颗粒通过调节通路进行分泌。在小鼠中通过转基因过表达AGRP会造成食欲过盛，从而出现肥胖和高血糖的症状，揭示了AGRP在摄食和能量消耗调控方面的重要作用。在中枢神经系统，AGRP主要通过对黑皮质素受体(特别是MC3R和MC4R)的抑制作用而刺激食欲上升。虽然AGRP抑制黑皮质素受体信号的确切机制尚不清楚，但根据目前的研究结果，AGRP主要具有两种功能：抑制α-MSH与黑皮质素受体的结合的竞争性拮抗剂(competitiveantagonist)功能和直接抑制黑皮质素受体活性的反向激动剂(inverseagonist)功能。在外周组织中，AGRP主要在肾上腺表达。大鼠在饥饿状态下，肾上腺皮质AGRP短型异构体上调，同时下丘脑AGRP短型异构体也上调。肥胖人群和禁食大鼠体内血浆中AGRP水平也会上调。正因为如此，AGRP在摄食和能量代谢中的作用目前已被大多数的学者所肯定。AGRP还能够通过调节下丘脑-垂体轴从而影响神经内分泌的功能。在大鼠中，脑腔注射AGRP会导致促甲状腺激素(TSH)以及血液循环中的T3、T4两种甲状腺激素水平的下降，从而使甲状腺功能受到抑制。尽管NPY对生殖的调控已被证实，但是有关其同源性物质AGRP及其递质，比如由AgRP神经元产生的GABA，对生殖方面的影响的信息很少，目前国外很多学者研究认为，AGRP通过下丘脑黑皮质素系统在生殖系统的调控过程中发挥了一定的作用。斜带石斑鱼俗称青斑，是一种鲈形目鮨科鱼类，由于其具有肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快速等特点，近年来已经成为福建、广东、海南、台湾四省重要的海水养殖鱼类。在水产养殖领域，利用AGRP强效和长效的食欲刺激效果，能够从内分泌水平提高养殖鱼类摄食量，促进其生长，从而达到缩短养殖周期和降低养殖成本的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其编码蛋白、含有所述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的表达载体。本专利技术的目的还在于提供一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法以及由该方法制备获得的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白。本专利技术的第三个目的在于提供上述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白在制备具有促进摄食功效的鱼类促食剂和鱼类饲料添加剂中的应用。本专利技术的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1，它的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。上述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。所述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的cDNA，其全长为432bp，它的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1。本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白。优选的，所述的寄主细胞是原核细胞或真核细胞。进一步优选的，所述的寄主细胞为大肠杆菌BL21。本专利技术还提供了一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的步骤的方法制备。本专利技术的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白在制备具有促进摄食功效的鱼类促食剂和鱼类饲料添加剂中的应用。本专利技术的斜带石斑鱼AGRP1重组蛋白可以用于制备鱼类新型促食剂和饲料添加剂，具有促进鱼类摄食和减少能量消耗的作用。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术利用生物信息学结合PCR技术，在斜带石斑鱼中克隆得到了摄食调控基因AgRP1，并构建了原核表达载体，其能够在大肠杆菌中大量表达斜带石斑鱼AgRP1基因所编码的蛋白；(2)在本专利技术中斜带石斑鱼AGRP1在下丘脑表达丰富，并参与了下丘脑中包括摄食和能量消耗在内的多种生理功能的调控，丰富了鱼类摄食系统信号通路的理论，在促进鱼类摄食和新型饲料添加剂的开发等方面具有十分重要的应用价值。附图说明图1是实施例1中斜带石斑鱼AgRP1基因的PCR扩增图；图2是实施例1中将重组质粒转化入BL21感受态细胞后菌液PCR鉴定结果；图3是实施例1中斜带石斑鱼AGRP1重组蛋白表达和纯化的SDS-PAGE(a图)及WesternBlot(b图)分析图，其中，M，蛋白分子量标准，A，菌体破碎后总蛋白，B，沉淀部分蛋白，C，上清部分蛋白，WesternBlot所使用的抗体为His标签抗体；图4是实施例1中不同浓度洗脱液洗脱条件优化，C，D，E，F泳道分别为PH8.0条件下洗脱液咪唑浓度为20mM、50mM、200mM、500mM的洗脱结果，A，B泳道为对照；图5是AGRP1重组蛋白纯化后的SDS-PAGE检测结果，箭头所指为重组蛋白目的条带；图6是实施例2中在人胚肾HKE-293T细胞系中进行的，斜带石斑鱼AGRP1对MC4R受体活性抑制作用的双荧光验证实验结果，A图为AGRP1重组蛋白对MC4R受体活性的直接抑制和对α-MSH与MC4R受体结合的竞争性拮抗效果的验证结果，各组之间显著性用不同字母标示；B图为不同浓度AGRP1重组蛋白对MC4R活性的影响；图7是实施例3中AGRP1重组蛋白在体注射斜带石斑鱼实验结果，A图为注射不同浓度AGRP1重组蛋白后3h和6h，其同源基因AgRP2的表达变化情况；B图为注射不同浓度AGRP1重组蛋白后3h和6h，抑制摄食基因POMC的表达变化。具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本专利技术。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、设备和方法为本
常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。实施例1斜带石斑鱼AGRP1重组蛋白的制备1、斜带石斑鱼总RNA的提取选取健康斜带石斑鱼4条，体长20-30cm，体重0.7-1kg，以冰浴麻醉约本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1，其特征是：它的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的编码蛋白，其特征是：它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种表达载体，其特征是：所述表达载体含有权利要求1所述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1。4.一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法，包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓春，贺蒙，李水生，蒙子宁，蔡春有，李波，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，海南晨海水产有限公司，阳江职业技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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