表达嵌合主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的基因修饰小鼠制造技术

本发明专利技术提供了一种表达人源化的MHC II蛋白(人源化的MHC IIα和β多肽)的基因修饰非人动物，以及包含该人源化MHC II蛋白的胚胎、细胞和组织。本发明专利技术还提供了制备所述基因修饰动物的构建体以及制备该构建体的方法。本发明专利技术提供了使用所述基因修饰动物对人免疫系统的不同方面进行研究的方法。

Transgenic mice expressing chimeric major histocompatibility complex (MHC) class II molecules

The present invention provides a genetically modified non-human animal expressing humanized MHC II proteins (humanized MHC II alpha and beta polypeptides), and embryos, cells and tissues containing the humanized MHC II protein. The invention also provides a construction for preparing the genetically modified animal and a method for preparing the recombinant body. The present invention provides a method for studying different aspects of the human immune system using the genetically modified animals.

【技术实现步骤摘要】
表达嵌合主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的基因修饰小鼠相关申请的交叉引用本申请是申请号为201280065075.7、申请日为2012年10月26日、专利技术名称为“表达嵌合主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的基因修饰小鼠”的中国专利技术专利申请的分案申请。原申请为国际申请号为PCT/US2012/062029的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2011年10月28日的美国临时专利申请号61/552,584的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。专利
本专利技术涉及基因改造的表达人源化的主要组织相容性复合物(MHC)II类蛋白的非人动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)及胚胎、组织和细胞。本专利技术进一步涉及制备表达人源化MHCII蛋白的基因修饰的非人动物的方法。本专利技术还提供了一种使用表达人源化MHCII类蛋白的非人动物、细胞和组织鉴定激活淋巴细胞和结合T细胞的肽，以及用于研发人用疫苗和其他治疗方法。专利技术背景在适应性免疫应答中，通过B淋巴细胞(例如免疫球蛋白)和T淋巴细胞(例如T细胞受体或TCR)上的受体分子识别外来抗原。这些外来抗原被专门的蛋白以肽片段呈现在细胞表面上，这些专门的蛋白通常称为主要组织相容性复合物(MHC)分子。MHC分子由多个基因座编码，已发现其为跨距约4Mb的相连的基因簇。在小鼠中，MHC基因位于17号染色体上，并且由于历史原因将其称为组织相容性2(H-2)基因。在人中，该基因位于6号染色体上，将其称为人白细胞抗原(HLA)基因。在小鼠和人中的基因座是多基因的；其包括三个高多态性类型的MHC基因(I、II和III类)，其在人和小鼠基因组中具有相似的构造(分别参见图2和图3)。MHC基因座在基因组中显示出最高的多态性；一些基因由>300个等位基因表示(例如人HLA-DRβ和人HLA-B)。所有I类和II类MHC基因均能提呈肽片段，但是各基因表达具有不同结合特性的蛋白，这反应了多态性和等位基因变体。任何给定个体均具有在免疫应答过程中能够提呈至B和T细胞表面的独特的肽片段范围。人与小鼠均具有II类MHC基因(参见图2和图3)。在人中，经典的MHCII基因被称为HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，而在小鼠中将其称为H-2A和H-2E(通常分别缩写为I-A和I-E)。由MHCII基因座中的基因编码的其他蛋白，在人中为HLA-DM和HLA-DO，以及在小鼠中为H-2M和H-2O，不存在于细胞表面，而是位于内吞小泡，并确保MHCII分子与肽的正确装载。II类分子由两条多肽链组成：α链和β链。α链的胞外部分含有两个胞外结构域α1和α2；并且β链的胞外部分也含有两个胞外结构域β1和β2(参见图1)。α链和β链彼此之间非共价结合。MHCII类分子在抗原提呈细胞(APC)上表达，例如B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、处于炎症过程中的内皮细胞等。在APC表面上表达的MHCII分子通常提呈在细胞内的小泡中产生的针对CD4+T细胞的抗原。为了参与与CD4+T细胞的结合，MHCII类与所关注抗原的复合物必须非常稳定的存在足够长时间以便与CD4+T细胞结合。当CD4+T辅助细胞与APC表面上的外源性肽/MHCII的复合物结合时，T细胞被活化以释放辅助针对侵入物的免疫应答的细胞因子。由于存在耐受机制，因而不是所有的抗原均激发T细胞活化。然而，在一些疾病(例如癌症、自身免疫性疾病)中来源于自身蛋白的肽成为免疫系统的靶细胞成分，结果导致提呈这种肽的细胞受到破坏。在识别具有临床意义的抗原方面已经取得了重要进步(例如与不同类型的癌症相关的抗原)。然而，为了改进对在人T细胞中激发适宜应答的肽的鉴定和选择，特别是具有临床意义抗原的肽，仍需要模拟人免疫系统各方面的体内和体外系统。因此，需要一种能够展示人免疫系统组分的生物系统(例如基因修饰的非人动物和细胞)。专利技术概述本申请提供了一种用于产生或鉴定肽的生物系统，所述的肽与人MHCII类蛋白及其嵌合体相关，并且与CD4+T细胞结合。本申请提供了一种非人动物，其包含表达在细胞免疫应答中具有功能的人源化分子的非人细胞。本申请还提供了一种编码人源化MHCII蛋白的人源化啮齿动物基因座。本申请还提供了一种表达人源化MHC分子的人源化啮齿动物细胞。本申请提供了包含人源化的啮齿动物细胞的体内和体外系统，其中所述啮齿动物细胞表达一个或多个人源化的免疫系统分子。本申请提供了一种非人动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，在其基因组中包含编码人源化MHCII复合物的核苷酸序列，其中所述人源化MHCII复合物的人源部分包含人MHCII复合物的胞外结构域，例如人源化MHCIIα胞外结构域和人源化MHCIIβ胞外结构域。在一个方面，本申请提供了一种非人动物，在其内源性MHCIIα基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，这种人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的人源部分包含人MHCIIα胞外结构域。在一个实施方式中，所述非人动物在动物细胞表面表达功能性MHCII复合物。在一个实施方式中，在动物中的人MHCIIα胞外结构域包含人MHCIIα1和α2结构域；在一个实施方式中，所述人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的非人源部分包含内源性非人源MHCIIα多肽的跨膜和胞质结构域。在一个实施方式中，编码人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的核苷酸序列在内源性非人源MHCIIα启动子和调控元件的调控下表达。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人源部分来源于选自下组的人源HLAII类蛋白：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP，例如人源部分来源于HLA-DR4蛋白。所述非人动物可以是啮齿动物，例如小鼠。在一个方面，所述非人动物在其内源性MHCIIα基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的核苷酸序列，其在内源性MHCIIβ基因座进一步包含编码人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的核苷酸序列。本申请还提供了一种制备基因修饰的非人动物的方法，所述动物在内源性MHCIIα基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的核苷酸序列。这种方法可以包括在内源性MHCIIα基因座使用编码人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的核苷酸序列取代编码内源性非人源MHCIIα多肽的核苷酸序列。本申请还提供了一种非人动物，所述动物在其内源性MHCIIβ基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，这种人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的人源部分包含人源MHCIIβ胞外结构域。在一个实施方式中，所述非人动物在动物细胞表面表达功能性MHCII复合物。在一个实施方式中，在所述动物中的人MHCIIβ胞外结构域包含人MHCIIβ1和β2结构域；在一个实施方式中，所述人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的非人部分包含内源性非人MHCIIβ多肽的跨膜和胞质结构域。在一个实施方式中，编码人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的核苷酸序列在内源性非人源MHCIIβ启动子和调控元件的调控下表达。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人源部分来源于选自下组的人源HLAII类蛋白：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP，例如所述人源部分来源于HLA-DR4蛋白。所述非人动物可以是啮齿动物，例如小鼠。在一个方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非人动物基因组，所述非人动物基因组包含：(a)在内源性主要组织相容性复合物II(MHC II)α基因座的编码人源/非人源嵌合MHC IIα多肽的核苷酸序列，其中所述人源/非人源嵌合MHC IIα多肽包含人MHC IIα1和α2结构域，所述人MHC IIα1和α2结构域可操作地连接至内源性非人MHC IIα多肽的跨膜和胞质结构域，并且/或者(b)在内源性主要组织相容性复合物IIβ基因座的编码人源/非人源嵌合MHC IIβ多肽的核苷酸序列，其中所述人源/非人源嵌合MHC IIβ多肽包含人MHC IIβ1和β2结构域，所述人MHC IIβ1和β2结构域可操作地连接至内源性非人MHC IIβ多肽的跨膜和胞质结构域。

【技术特征摘要】
2011.10.28 US 61/552,5841.一种非人动物基因组，所述非人动物基因组包含：(a)在内源性主要组织相容性复合物II(MHCII)α基因座的编码人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的核苷酸序列，其中所述人源/非人源嵌合MHCIIα多肽包含人MHCIIα1和α2结构域，所述人MHCIIα1和α2结构域可操作地连接至内源性非人MHCIIα多肽的跨膜和胞质结构域，并且/或者(b)在内源性主要组织相容性复合物IIβ基因座的编码人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的核苷酸序列，其中所述人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽包含人MHCIIβ1和β2结构域，所述人MHCIIβ1和β2结构域可操作地连接至内源性非人MHCIIβ多肽的跨膜和胞质结构域。2.一种分离的非人动物细胞，所述非人动物细胞在内源性主要组织相容性复合物II(MHCII)α基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的核苷酸序列，并且/或者，在内源性主要组织相容性复合物IIβ基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的核苷酸序列，其中所述人源/非人源嵌合MHCIIα多肽的人源部分包含人MHCIIα2结构域，并且/或者，所述人源/非人源嵌合MHCIIβ多肽的人源部分包含人MHCIIβ2结构域。3.一种体外组合物，包括：根据权利要求2所述的第一细胞。4.一种核酸，所述核酸包含编码人源/非人源嵌合MHCIIα多...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·麦克唐纳，A·J·莫菲，N·图，C·古雷尔，V·沃罗宁那，S·史蒂文斯，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US