【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与生物医药，具体涉及一种人源化的cd19car的检测。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
的信息旨在增加对本专利技术总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、car-t细胞疗法是通过外源基因转导技术，把识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段 (singlechain antibody fragment，scfv)和t细胞活化序列的融合蛋白表达到 t细胞表面，这样scfv通过跨膜区与t细胞胞内的活化增殖信号域偶联，经回输患者体内后大量扩增，能够以抗原依赖、非mhc限制性的模式表现出较强的抗肿瘤作用。
3、目前针对血液系统恶性肿瘤的car-t细胞种类很多，其中以靶向cd19分子的嵌合抗原受体基因修饰的t细胞（cd19 car-t）在血液肿瘤治疗临床试验上取得的成就最为突出。但是目前上市的car-t产品中car-t技术所应用的cd19抗原受体是采用鼠源基因，例如鼠源单克隆抗体fmc63，此类鼠源基因片段在治疗人类疾病过程中有引起人抗鼠抗体（hama, human anti-mouse antibodies）的产生的可能性。有研究显示鼠源car序列产生的免疫原性可能导致car-t细胞无法活化及持续存在。人源化的cd19 scfv能够有效避免鼠源cd19基因导致的人抗鼠抗体的产生，降低鼠源car的免疫原性，能够改善car-t细胞的存活时间，高特异性的与人源cd19蛋白结合，增强car-t的治疗效果，提高car-t治疗的安全性和有效性
4、大量临床研究表明，car-t细胞在体内的持续增殖是确保治疗效果的关键因素。car-t细胞数或者car基因拷贝数的动态监测，有助于评估与临床响应和临床毒性相关的细胞动力学参数，同时也具有预后价值，可用于确定治疗效果。根据部分获批疗法披露的信息，yescarta (2017)、tecartus (2020)和carvykti (2022) 的人体pk研究采用了检测car+细胞数的流式细胞方法，而kymriah (2017)、abecma (2021)和breyanzi (2021)的人体pk研究采用了检测car基因拷贝数的荧光定量pcr(qpcr)方法。
5、对于流式细胞法检测car转染阳性率的方法，目前，有针对car不同结构区域的检测方法，包括针对car抗原结合位点的，比如cd19抗原和抗独特型抗体，或针对轻链或铰链区的抗fab抗体、protein l蛋白等，然而，现有的这些检测试剂仍具有一些缺点，检测效果难以令人满意。其中，抗fab抗体和protein l染色前后需要严格洗涤，否则会与非car的igg样蛋白交叉反应而出现严重非特异，检测car的特异性较差，而且无法区分不同scfv构建的不同靶点car。针对抗原结合部位的car阳性率检测方法的靶点特异性较强，但其car阳性率的检测效果受到靶点蛋白与scfv抗体等检测试剂之间的特异性、灵敏度和亲和力的直接影响，因此限制了car阳性检测的应用。
6、目前car基因拷贝数的检测行业内普遍采用qpcr的方法。但是qpcr需要已知浓度的标准品需要参考标准曲线进行定量，误差较大，且每个样本需要至少3次重复，操作相对繁琐；检测灵敏度低，对于低浓度模板检测结果无法确定；许多因素如pcr抑制剂等，会影响pcr扩增效率的稳定性；重复性较差，不同的环境和操作对检测结果影响较大。
7、数字pcr（ddpcr）是一种最新的核酸分子定量技术，基于单分子pcr方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。与传统的荧光定量相比，ddpcr的优势除了可实现单细胞分析、绝对定量、无需标准曲线等特点之外，还包括：检测下限极低，可检测单拷贝值，可实现单分子检测，灵敏性可提高100倍以上；对pcr抑制物有更高的耐受性，不依赖扩增效率，检测准确性更高；参数精简，无需统计ct值，从而大大提高了精确度；数据分析自动化，每个微滴的检测结果由设备直接判断；使用灵活，可按照实验需要调整通量和灵敏度。利用数字pcr技术，可以快速、灵敏、准确地定量各种体液中car拷贝数，从而为有效的指导细胞治疗进一步安全的实施提供依据。
8、现有技术中有针对car的共刺激结构域的引物如cd28和4-1bb等，其缺点是不能针对特异性靶点的car-t进行检测，如序贯治疗中回输针对两种靶点或两种以上的car-t时，无法进行区分，而且人体内本身也存在cd28、4-1bb，检测结果并不完全精确。
技术实现思路
1、针对现有检测靶标可能导致的非特异性检出等问题，本专利技术提供一种检测人源化cd19 scfv基因的方法，采用微滴式数字pcr（ddpcr）的方法，特异性强，可重复性强，灵敏度高。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
3、一种检测人源化cd19 scfv基因的引物探针组，所述引物包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如seq id no:1和2所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no:3所示，且5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团。
4、5’端荧光报告基团至少选自fam、hex、vic、rox、cy5中任一一种，3’端荧光淬灭基团至少选自bhq1、tamra、joe、bhq2、bhq3、mgb中任一一种。
5、在一些实施例中，探针的5’端连接fam，3’端连接bhq1。
6、所述人源化cd19 scfv基因的核苷酸序列如seq id no: 4所示；包括由连接肽连接的轻链可变区、
7、一种包含上述引物探针组的检测人源化cd19 scfv基因的试剂盒。
8、上述试剂盒还可以包括pcr反应预混液、无核酸酶水、微液滴生成油。
9、一种检测人源化cd19 scfv基因的方法，包括以下步骤：
10、（1）提取待测样品中的dna；
11、（2）以dna为模板，以上述引物探针组或试剂盒进行数字pcr；
12、（3）进行结果分析。
13、本专利技术具有以下优点：
14、本专利技术提供了一种人源化的cd19car的检测方法，采用如seq id no:1-3所示的上游引物、下游引物和探针，探针的5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团，其检测靶标为核苷酸序列如seq id no: 4所示的人源化cd19 scfv基因。本专利技术建立的检测方法无需标准品，操作检测，具有特异性强，可重复性强，灵敏度高等特点，可以快速、灵敏、准确地定量car拷贝数，解决了现有检测靶标可能导致的非特异性检出的问题，可以为生产car-t细胞和指导细胞治疗提供依据。
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1.一种检测人源化CD19 scFv基因的引物探针组，其特征在于，引物包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，且5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX或Cy5中任一一种；荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2、BHQ3或MGB中任一一种。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述人源化CD19 scFv基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
5.一种包含如权利要求1-4任一引物探针组的检测人源化CD19 scFv基因的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还可以包括PCR反应预混液、无核酸酶水、微液滴生成油。
7.一种检测人源化CD19 scFv基因的方法，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种检测人源化cd19 scfv基因的引物探针组，其特征在于，引物包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如seq id no:1和2所示；探针的核苷酸序列如seq id no:3所示，且5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，荧光报告基团选自fam、hex、vic、rox或cy5中任一一种；荧光淬灭基团选自bhq1、tamra、joe、bhq2、bhq3或mgb中任一一种。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔群芳，张慧慧，谭毅，隋英丽，赵红燕，
申请(专利权)人：山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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