【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种基因修饰间充质干细胞的制备。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
的信息旨在增加对本专利技术总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、急性肺损伤(ali)主要由多发性外伤、失血性休克、严重烧伤等直接或间接引起，其中脓毒症和肺炎引起ali的风险较高，临床具体表现为急性呼吸窘迫综合症(acuterespira torydistresssyndrome，ards)。目前认为ali/ards的本质为多种炎症细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞等)及其释放的炎症介质，细胞因子间接导致肺脏炎症反应。免疫系统被过度激活时会生成大量的炎症因子，导致严重的细胞因子风暴，细胞因子风暴可导致肺及多器官损伤。轻者可表现为急性自限性症状，如发热、乏力、干咳、流涕等，重者可出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍以及多器官功能障碍综合征甚至死亡等。急性呼吸窘迫综合征（ards）由于其发病率、发病率和死亡率，以及缺乏最佳治疗方法，是当前医学面临的一个挑战。
3、间充质干细（mscs）是一类多潜能组织干细胞，可从骨髓、尿液、脐带、胎盘、月经血、脂肪组织、脐带血等全身各处组织中分离纯化，并且易于在体外分离培养和迅速扩增，凭借归巢和旁分泌能力，mscs能够迁移到受损组织部位并释放细胞外囊泡、生长因子、多种细胞调节因子以及趋化因子等以调节免疫反应并修复受损组织。此外，由于mscs中缺乏人类白细胞ⅱ类抗原表达，可以在没有供体-受体匹配
4、但是，为了选择治疗ali/ards的最佳msc必须解决以下各种限制：（1）允许它们在体外存活周期长，（2）允许它们有较强的t细胞免疫调节能力，（3）允许它们在体外有迁移与归巢能力，（4）允许它们有较好的血管生成能力。上述的msc不仅能显著减少肺损伤，而且还能提高患者的恢复，为干细胞临床治疗ards应用提供更加科学和严谨的数据支撑。间充质干细胞与靶标部位或细胞的互作主要通过细胞外囊泡、生长因子、多种细胞调节因子以及趋化因子等介质，然而，这些介质涉及信号的传导、跨膜蛋白转运、免疫相关系统以及细胞的生长和死亡等多个通路。然而，现阶段对于mscs的作用机制的研究仍然有限，且已经报道的研究相互之间还存在相反的结论。因此，开发并筛选获得特定功能亚群的间充质干细胞为精准医学治疗手段还有较大的提升空间及现实的必要性。
技术实现思路
1、针对现有技术中针对ards缺乏有效治疗手段、干细胞治疗的靶向性差等问题，本专利技术提供一种同时表达肿瘤坏死因子α刺激基因-6（tsg6）、转化生长因子β1（tgf-β）、前列腺素e2（pge2）的间充质干细胞，表现出良好的活性、增殖率、体外存活率、对t细胞免疫抑制能力、迁移与归巢能力。
2、本专利技术还提供了一种表达tsg6/tgf-β/pge2的间充质干细胞用于治疗ards的应用。本专利技术发现表达tsg6/tgf-β/pge2人脐带间充质干细胞显著提高了干细胞对急性肺损伤的治疗效果。
3、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
4、一种共表达tsg6/tgf-β/pge2的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
5、（1）将携带tsg6、tgf-β和pge2的转移质粒在哺乳细胞中包装慢病毒；
6、（2）将步骤（1）中的慢病毒侵染间充质干细胞；
7、（3）筛选三种细胞因子阳性表达的间充质干细胞。
8、在一些实施例中，所述哺乳动物细胞为293t或293ft细胞；可表达tsg6、tgf-β和pge2的载体的骨架质粒为plvx载体质粒或pcdh载体质粒。
9、慢病毒的包装可以采用公知常识或现有技术中的方法，如构建包装质粒、包膜质粒、含目的基因的转移质粒的三质粒系统共转染细胞，在细胞中完成慢病毒完整结构的包装，获得携带目的基因的慢病毒。在一些实施例中，包装质粒为pspax2质粒载体、包膜质粒为pmd2.g质粒载体。
10、为了提高安全性，慢病毒的包装还可以采用包装质粒1、包装质粒2、包膜质粒、含目的基因的转移质粒的四质粒系统共转染细胞完成慢病毒包装。在一些实施例中，包装质粒为pspax2质粒载体、包膜质粒为pmd2.g质粒载体。在一些实施例中，包装质粒1和2分别为plp1和plp2，包膜质粒为plp/vsvg。
11、所述间充质干细胞的来源不限，如胎盘组织，如脐带，脂肪，骨髓，牙髓，血液。
12、一种共表达tsg6/tgf-β/pge2的间充质干细胞，共同表达三种细胞因子的比例不低于90%；或不低于95%；或不低于98%。
13、上述间充质干细胞可用于治疗急性肺损伤。
14、可抑制th1/17介导的炎症反应，间充质干细胞分泌的pge2还通过靶向巨噬细胞极化来增强抑制因子il-10的释放，tsg6通过其糖胺聚糖结合位点与cxcl8等趋化因子结合，导致中性粒细胞募集受到抑制，tsg6参与促炎活动的其他趋化因子（如ccl2和ccl5）结合。从而减弱炎症分子的水平，为组织恢复提供合适的环境。
15、另外，间充质干细胞分泌的tgf-β可以抑制il-3、gm-csf、m-csf所诱导小鼠造血前体细胞和ltbmc的集落形成，并降低巨核细胞对il-3t和csf的反应性。tgf-β在治疗伤口愈合，促进软骨和骨修复以及通过免疫抑制治疗自身免疫性疾病和移植排斥等方面有潜在的应用前景。
16、本专利技术具有以下优点：
17、本专利技术通过基因工程构建表达的tsg6、tgf-β和pge2的慢病毒并转染间充质干细胞并成功表达，构建了工程化的间充质干细胞，可长期共表达三种细胞因子。该工程化间充质干细胞在三系分化能力和未改造前的并无差别，并且具有良好的活性、增殖率、体外存活率、对t细胞免疫抑制能力、迁移与归巢能力。通过构建急性肺损伤模型发现，相较未改造的间充质干细胞，该工程化间充质干细胞显著提高了对急性肺损伤的治疗效果。因此，本专利技术提供的工程化间充质干细胞具有应用于临床治疗的潜力。
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1.一种共表达TSG6/TGF-β/PGE2的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为293T或293FT细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，可表达TSG6、TGF-β和PGE2的载体的骨架质粒为pLVX载体质粒或pCDH载体质粒。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包装慢病毒的方法为：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞选自胎盘组织、脂肪、骨髓、牙髓、血液。
6.一种根据权利要求1-5任一方法制备的共表达TSG6/TGF-β/PGE2的间充质干细胞，其特征在于，共同表达三种细胞因子的比例不低于90%；或不低于95%；或不低于98%。
7.一种利用如权利要求6所述的间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种共表达tsg6/tgf-β/pge2的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为293t或293ft细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，可表达tsg6、tgf-β和pge2的载体的骨架质粒为plvx载体质粒或pcdh载体质粒。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包...
【专利技术属性】
技术研发人员：王胜男，马贺然，谭毅，赵丹风，王玉森，
申请(专利权)人：山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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