【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。
技术介绍
1、达芦那韦(darunavir)是fda批准用于抗人类免疫缺陷病毒(hiv)感染的新药，是第二代hiv蛋白酶抑制剂，可以阻断hiv病毒复制的蛋白酶，当与其他抗hiv药物联用时，可以降低病毒载量，提高免疫能力。达芦那韦是由强生公司的子公司爱尔兰的泰博特克药品公司(tibotec)开发，于2006年7月首次在美国上市，其商品名为：prezista，化学名为：[(1r，5s，6r)-2，8-二氧双环[3.3.0]-癸烷-6-基]-n-[(2s，3r)-4-[(4-氨基苯基)磺酰基-(2-甲基丙基)氨基]-3-羟基-1-苯基-丁烷-2-基]氨基甲酸酯。达芦那韦已在美国、欧盟及其他国家和地区上市。
2、手性化合物i是合成达芦那韦的中间体，其具有如图1所示的结构式。该化合物及其异构体的合成包括手性催化和酮还原酶催化合成。
3、文献more,ganesh v.,et al."ru-catalyzed asymmetric transferhydrogenation ofα-acyl butyrolactone via dynamic kinetic resolution:asymmetric synthesis of bis-thf alcohol intermediate of darunavir."tetrahedron letters 66(2021):152831.研究了手性钌配体催化剂(r,r)-ru-fsdpen构建化合
4、现有专利中已涉及利用酶催化合成化合物i，欧洲专利ep2634180a1涉及使用不同羰基还原酶来催化制备多种手性达芦那韦中间体，并且提及化合物i及其异构体的合成，其中16种羰基还原酶均为来自codexis inc.的商业酶，其中包括来自saccharomycescerevisiae ynl331c的酮还原酶催化反应合成化合物i，并披露了该酮还原酶相关信息(该专利已被撤销)；cn110372641b(同族专利wo2019196263a1)，以及cn110272398b(同族专利wo2019174176a1)，披露用来自saccharomyces kudriavzevii的醛酮还原酶催化合成多种达芦那韦手性中间体，包括提及化合物i的制备。
5、但是上述专利中存在所用酶的选择性还不够理想、酶活力偏低，投料浓度低，投酶量大，原料转化不完全等问题，导致成本高，反应物需分离产物和剩余原料等。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。
2、本专利技术提供了酮还原酶在达芦那韦中间体合成中的应用，所述酮还原酶具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
3、本专利技术提供了酮还原酶突变体，所述的酮还原酶突变体包括如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸和如下所示突变中的至少一种：
4、第257位谷氨酸突变为天冬氨酸；和/或
5、第259位亮氨酸突变为丙氨酸；和/或
6、第272位谷氨酸突变为丝氨酸。
7、进一步的，本专利技术所述的酮还原酶突变体包括：
8、如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸和第259位亮氨酸突变为丙氨酸；或
9、如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸，第259位亮氨酸突变为丙氨酸和第272位谷氨酸突变为丝氨酸；或
10、如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸、第257位谷氨酸突变为天冬氨酸和和第259位亮氨酸突变为丙氨酸；或
11、如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸，第257位谷氨酸突变为天冬氨酸，第259位亮氨酸突变为丙氨酸和第272位谷氨酸突变为丝氨酸。
12、本专利技术以筛选得到的源于saccharomyces cerevisiae s288c的野生型酮还原酶进行突变，获得酮还原酶突变体，第一次将其应用于达芦那韦中间体的合成，与野生型酮还原酶相比，本专利技术所述酮还原酶突变体对底物(酮化合物ii)的反应具有更高的酶活力和立体选择性，酶用量明显减少，反应产物i的异构体纯度大幅度提高，能够更好的满足工业化生产需求。并且本专利技术中，酮还原酶突变位置的不同，获得的突变体的转化率以及最终产物异构体纯度存在差异；其中，以如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸和第259位亮氨酸突变为丙氨酸的酮还原酶突变体的转化率达到99.02％，纯度达到97％；以如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸，第259位亮氨酸突变为丙氨酸和第272位谷氨酸突变为丝氨酸的酮还原酶突变体的转化率达到99.48％，纯度达到96.92％；以如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸、第257位谷氨酸突变为天冬氨酸和和第259位亮氨酸突变为丙氨酸的酮还原酶突变体的转化率达到99.24％，纯度达到96.21％；以如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸，第257位谷氨酸突变为天冬氨酸，第259位亮氨酸突变为丙氨酸和第272位谷氨酸突变为丝氨酸的酮还原酶突变体的转化率达到99.86％，纯度达到96.20％。
13、本专利技术提供了组合物，其包括组合物1或组合物2中的任意一种，
14、所述组合物1包括：辅酶再生酶和酮还原酶；
15、所述组合物2包括：辅酶再生酶和本专利技术所述的酮还原酶突变体；
16、所述辅酶再生酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种；
17、所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:6所示；
18、所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:7所示；
19、所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:8所示；
20、所述酮还原酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
21、本专利技术提供了酮还原酶制剂、酮还原酶突变体酶制剂，或所述组合物制剂，所述制剂可以为固体、液体或半固体，所述制剂中还可以包括稳定剂、表面活性剂、缓冲液等，用于维持或协助所述酶的保存或发挥作用。
22、本专利技术提供了生物材料，其包括如下a)～d)所示中的至少一种：
23、a)、编码本专利技术所述的酮还原酶变体或本专利技术所述的组合物的核酸；
24、b)、含有a)所述核酸的重组载体；
25、c)、转化或转染如b)所述重组载体的宿主细胞；
26、d)、培养如c)所述的宿主细胞获得的混合物。
27、本专利技术所述的核酸可以是dna、r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.酮还原酶突变体，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸和如下所示突变中的至少一种：
2.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体包括：
3.组合物，其特征在于，包括组合物1或组合物2中的任意一种，
4.生物材料，其特征在于，包括如下A)～D)所示中的至少一种：
5.如下i)～iv)所示中的至少一种在达芦那韦中间体合成中的应用:
6.达芦那韦中间体的制备方法，其特征在于，包括利用如下I)～IV)所示中的至少一种进行达芦那韦中间体合成：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，
10.根据权利要求7～9任一项所述的制备方法，其特征在于，
【技术特征摘要】
1.酮还原酶突变体，其特征在于，包括如seq id no:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸和如下所示突变中的至少一种：
2.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体包括：
3.组合物，其特征在于，包括组合物1或组合物2中的任意一种，
4.生物材料，其特征在于，包括如下a)～d)所示中的至少一种：
5.如下i)～iv)所示中的至少一...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗积杏，壮晓健，童杰，王红艳，李原强，
申请(专利权)人：瑞博苏州制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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