【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米硒合成，特别涉及一种提高酿酒酵母合成的纳米硒稳定性的方法。
技术介绍
1、硒的缺乏可诱导或加剧骨骼肌、心肌坏死、免疫功能下降和肿瘤疾病等。有研究证明，饮食中补硒的剂量，在超营养水平能够表现出良好的预防和治疗癌症效果，但此时的剂量与硒的慢性毒性剂量很接近。
2、在自然界中，硒的存在形式包括无机硒和有机硒，无机形式存在三个价态：硒酸盐(+6价)、亚硒酸盐(+4价)、硒化物(-2价)和单质硒(0价)。其中单质硒是通过物理、化学或微生物转化的方法将无机硒还原成零价的单质硒，这种方式合成的单质硒有灰色、黑色和红色三种存在形式。研究表明粒径在5～200nm之间的红色纳米硒才具有明显的生物学效应。相比较硒化合物，纳米硒具有更好的生物相容性，更低的细胞毒性，并且生物活性好于无机硒和有机硒。有研究能够表明，纳米硒在调整细胞与缺硒动物含硒酶的能力方面与亚硒酸钠表现相似，但是亚硒酸钠在急性毒性表现方面是纳米硒的7倍。纳米硒在清除自由基的表现上也强于亚硒酸钠。
3、与化学法合成的纳米硒相比，微生物法合成的纳米硒颗粒稳定性高、耐高温性能强，更易于被机体吸收，粒径均匀，毒性小。酿酒酵母是常见的生物安全菌株，且菌株对恶劣培养条件的耐受性强，发酵技术成熟，在工业发酵生产中具有广泛应用。纳米硒用途广泛，可以应用于农业、医疗、环境治理、化妆品行业、生物传感器、生物医用材料等领域。有必要进一步提高微生物法合成的纳米硒颗粒稳定性，有利于扩展纳米硒的应用场景。
4、本专利技术分离鉴定了纳米硒表面的三个主要蛋白，发现提
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种提高酿酒酵母合成的纳米硒稳定性的方法，该方法提高纳米硒表面蛋白act1的表达水平，从而得到酸碱稳定性和温度稳定性显著提高的纳米硒颗粒。高稳定性将使纳米硒在加工条件和应用环境中保持生物活性，有助于它作为纳米药物或营养补充剂治疗硒缺乏等方面的潜在应用。
2、本专利技术采用的技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种重组酿酒酵母工程菌，所述重组酿酒酵母工程菌是酿酒酵母经过以下基因工程改造构建：将谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(gsh1)的表达盒与谷胱甘肽合成酶基因(gsh2)的表达盒插入yprcδ15位点；将超氧化物歧化酶基因(sod1)的表达盒与谷胱甘肽氧化还原酶基因(glr1)的表达盒插入ubp6位点；将actin基因的表达盒插入yprcτ3位点。
4、yprcδ15位点高表达谷胱甘肽合成路径中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因gsh1和谷胱甘肽合成酶编码基因gsh2，进一步ubp6位点高表达谷胱甘肽还原酶编码基因glr1和超氧化物歧化酶编码基因sod1，并且尤其推荐使用强启动子驱动act1基因，整合到酿酒酵母基因组上构建获得的。本专利技术所述的改造都采用crispr/cas9系统完成。
5、进一步，所述酿酒酵母为酿酒酵母cicc 1406；所述强启动子是tdh3、tef1启动子。
6、在本专利技术的一个实施例中，所述谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(gsh1)的表达盒的启动子为tef1启动子。进一步，所述谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(gsh1)的核苷酸序列的sgd数据库编号为s000003637。
7、在本专利技术的一个实施例中，所述谷胱甘肽合成酶基因(gsh2)的表达盒的启动子为tdh3启动子。进一步，所述谷胱甘肽合成酶基因(gsh2)的核苷酸序列的sgd数据库编号为s000005409。
8、在本专利技术的一个实施例中，所述超氧化物歧化酶基因(sod1)的表达盒的启动子为tdh3启动子。进一步，所述超氧化物歧化酶基因(sod1)的核苷酸序列的sgd数据库编号为s000003865。
9、在本专利技术的一个实施例中，所述谷胱甘肽氧化还原酶基因(glr1)的表达盒的启动子为tef1启动子。进一步，所述谷胱甘肽氧化还原酶基因(glr1)的核苷酸序列的sgd数据库编号为s000006012。
10、进一步，所述actin蛋白基因的表达盒中actin蛋白基因的核苷酸序列的sgd数据库编号为s000001855。更进一步，所述actin蛋白基因的表达盒的启动子为tdh3启动子。
11、在本专利技术的实施例中，最后一步改造是将以下表达盒之一插入yprcτ3位点：actin蛋白基因(act1)的表达盒、dna解旋酶基因(rrm3)的表达盒、热应激蛋白基因(hsp104)的表达盒，最终发现将actin基因(act1)的表达盒插入yprcτ3位点，得到的纳米硒稳定性最佳。
12、在本专利技术的实施例中，所述actin蛋白基因(act1)的表达盒的启动子为tdh3启动子。在本专利技术的一个实施例中，所述dna解旋酶基因(rrm3)的表达盒的启动子为tdh3启动子。在本专利技术的一个实施例中，所述热应激蛋白基因(hsp104)的表达盒的启动子为tdh3启动子。
13、上述基因和启动子都来自酿酒酵母cicc 1406，本领域人员知晓，采用化学合成也可以达到目的。
14、第二方面，本专利技术还提供一种所述重组酿酒酵母工程菌在发酵转化亚硒酸钠制备纳米硒中的应用。
15、具体地，所述应用为：将所述重组酿酒酵母工程菌接种至ypd液体培养基，28-31℃、150-250r/min培养15h，得到种子液；
16、将所述种子液以8-15％(优选10％)的体积接种量接种至新鲜ypd液体培养基中，28-31℃培养24h后，加入终浓度为1600-2200mg/l的亚硒酸钠，继续在28-31℃、150-250r/min下进行发酵培养，获得含纳米硒的发酵液。
17、优选地，所述亚硒酸钠的终浓度为2000mg/l。在本专利技术的实施例中，所述亚硒酸钠先用水溶解制成10000mg/l的水溶液，再使用孔径0.22μm滤膜过滤后再加入。
18、进一步，所述发酵培养的条件优选为30±0.5℃，200±5r/min，48h。
19、进一步，所述ypd液体培养基由以下终浓度的各组分组成：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l，溶剂为去离子水，ph自然。
20、本专利技术对酿酒酵母yj003菌株所合成的纳米硒表面蛋白进行分离，将获得的蛋白测序结果在酿酒酵母数据库中进行比对，确定分别是肌动蛋白act1、dna解旋酶rrm3、热应激蛋白hsp104。分别将这三个蛋白质的基因插入位点yprcτ3，使用强启动子tdh3进行高表达，研究三种蛋白质对纳米硒稳定性的影响。通过确定纳米硒颗粒对金属离子、酸、碱、氧化剂和各种热条件的稳定性，研究了提高表面结合蛋白表达量对纳米硒稳定性的影响。
21、与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：提供了一种通过提高act1蛋白基因的表达量，从而显著提高纳米硒颗粒的温度稳定性和酸碱稳定性的方法。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述重组酿酒酵母工程菌是酿酒酵母经过以下基因工程改造构建：将谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表达盒与谷胱甘肽合成酶基因的表达盒插入YPRCΔ15位点；将超氧化物歧化酶基因的表达盒与谷胱甘肽氧化还原酶基因的表达盒插入Ubp6位点；将Actin基因的表达盒插入YPRCτ3位点。
2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述酿酒酵母为酿酒酵母CICC 1406。
3.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表达盒的启动子为TEF1启动子；所述谷胱甘肽合成酶基因的表达盒的启动子为TDH3启动子。
4.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述超氧化物歧化酶基因的表达盒的启动子为TDH3启动子；所述谷胱甘肽氧化还原酶基因的表达盒的启动子为TEF1启动子。
5.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的核苷酸序列的SGD数据库编号为S000003637；所述谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列的SGD数据库编号为S
6.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述Actin蛋白基因的核苷酸序列的SGD数据库编号为S000001855。
7.如权利要求6所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述Actin蛋白基因的表达盒的启动子为TDH3启动子。
8.如权利要求1-7任一项所述的重组酿酒酵母工程菌在发酵转化亚硒酸钠制备纳米硒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述重组酿酒酵母工程菌接种至YPD液体培养基，28-31℃、150-250r/min培养15h，得到种子液；
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述发酵培养的条件为30±0.5℃，200±5r/min，48h；所述YPD液体培养基由以下终浓度的各组分组成：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
...【技术特征摘要】
1.一种重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述重组酿酒酵母工程菌是酿酒酵母经过以下基因工程改造构建：将谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表达盒与谷胱甘肽合成酶基因的表达盒插入yprcδ15位点；将超氧化物歧化酶基因的表达盒与谷胱甘肽氧化还原酶基因的表达盒插入ubp6位点；将actin基因的表达盒插入yprcτ3位点。
2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述酿酒酵母为酿酒酵母cicc 1406。
3.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表达盒的启动子为tef1启动子；所述谷胱甘肽合成酶基因的表达盒的启动子为tdh3启动子。
4.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述超氧化物歧化酶基因的表达盒的启动子为tdh3启动子；所述谷胱甘肽氧化还原酶基因的表达盒的启动子为tef1启动子。
5.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的核苷酸序列的sgd数据库编号为s000003637；所述谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列的sgd数...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙杰，郑轶烜，袁梦杰，王宇光，章银军，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。