CTLA-4基因的用途及相关药物制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，更具体地涉及CTLA‑4基因的用途及其相关药物。本发明专利技术设计了针对人CTLA‑4基因的134个RNAi靶点序列，构建相应的CTLA‑4 RNAi，使用转染载体将CTLA‑4 RNAi导入T细胞，能够降低T细胞中CTLA‑4基因的表达水平，显著抑制细胞中CTLA‑4的表达，促进T细胞活化。

【技术实现步骤摘要】
CTLA-4基因的用途及相关药物
本专利技术涉及生物
，更具体地涉及CTLA-4基因的用途及相关药物。
技术介绍
细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)又名CD152，是由CTLA-4基因编码的一种跨膜蛋白质，表达于活化的T细胞，与T细胞表面的协同刺激分子受体(CD28)具有高度的同源性，能够结合抗原呈递细胞(APC)上的协同刺激分子B7，但不同于CD28，CTLA-4与B7分子结合后抑制T细胞活化。其机制一是与CD28竞争性的结合B7或者招募磷酸酶到CTLA-4的胞内结构域部分从而降解T细胞受体(TCR)和CD28的信号，二是降低CD80/CD86在APC的表达水平或者通过转胞吞作用将它们从APC上移除，这样就减少了CD28参与激活T细胞。此外CTLA-4还会介导树突细胞结合CD80/CD86并诱导色氨酸降解酶IDO的表达，从而导致TCR的抑制。伴随外源性抗原或肿瘤特异性靶抗原的刺激，T细胞被激活，CTLA-4表达水平上升抑制T细胞的免疫反应。因此阻断CTLA-4的免疫效应可刺激T细胞增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。目前CTLA-4抗体Ipilimumab已于2011年被FDA批准用于治疗黑色素瘤。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。已有很多针对不同基因的干扰RNA在体内和体外有效的抑制了肿瘤细胞的生长，这些目的基因包括：Bcl-2、survivin、EGFR、VEGF等。RNA干扰代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比，RNA干扰技术设计更简便、作用迅速、效果明显，其技术优势还在于能根据不同病情，设计个体化治疗方案。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开与人CTLA-4基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰(RNAi)为手段下调CTLA-4基因在T细胞中的表达。进而，防止CTLA-4与B7分子结合后抑制T细胞活化。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供了一种促进T细胞活化的方法，为降低T细胞中CTLA-4基因的表达，从而促进T细胞的活化。优选地，所述方法包括但不限于特异性抑制CTLA-4基因的转录或翻译，或特异性抑制CTLA-4蛋白的表达或活性。所述促进T细胞活化包括但不限于：刺激T细胞增殖和/或增强抗肿瘤免疫反应。具体地，所述降低肿T细胞中CTLA-4基因的表达水平，可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：抑制CTLA-4基因的转录或翻译。抑制的方法可采用基因敲除，基因敲低使CTLA-4基因失活或活性降低；或者也可利用抗体、蛋白、小分子等与CTLA-4基因的表达产物结合使相关基因表达产物降低。作为典型的代表，例如可以RNA干扰为手段，降低T细胞中CTLA-4基因的表达水平。所述的促进T细胞活化的方法可以是体内或体外的。采用本专利技术的方法体外处理后活化的T细胞可被用于治疗的或非治疗目的。本专利技术的第二方面，提供了一种促进T细胞活化的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CTLA-4基因杂交的核苷酸序列；或者b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CTLA-4基因杂交的核苷酸序列。进一步地，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CTLA-4基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与CTLA-4基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与CTLA-4基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。优选地，所述CTLA-4基因来源于人。更进一步地，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CTLA-4基因中的靶序列基本相同。所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。优选地，所述CTLA-4基因中的靶序列选自如SEQIDNO：1～134所示之任一序列或如SEQIDNO：1～134所示之任一序列经过取代、缺失或添加一个或几个碱基序列且具有与如SEQIDNO：1～134所示之任一序列相同活性的序列。优选地，所述经过取代、缺失或添加一个或几个碱基序列具体是指在如SEQIDNO：1～134所示之任一序列的5’或3’端增加或减少5个以下碱基，或在序列中突变少于2个碱基，或既有碱基的加减也有碱基突变。进一步地，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。更进一步地，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQIDNO：135～268任一序列所示。进一步地，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CTLA-4基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默T细胞中内源CTLA-4基因表达的作用。更进一步地，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CTLA-4基因中的靶序列基本相同。较佳的，所述正义链片段与CTLA-4基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与CTLA-4基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。更进一步的，所述shRNA的序列如SEQIDNO:269～402任一序列所示。shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默T细胞内源性CTLA-4基因表达的作用。所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与CTLA-4基因中的靶序列基本相同，所述CTLA-4基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默CTLA-4基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的CTLA-4基因的片段。较佳的，所述CTLA-4基因中的靶序列含有SEQIDNO:1-134之任一序列。进一步的，所述CTLA-4基因来源于人。本专利技术的第三方面，提供一种CTLA-4基因干扰核酸构建体，含有编码本专利技术所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。所述的CTLA-4基因干扰核酸构建体可以是将编码前述CTLA-4shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步地，所述CTLA-4基因干扰核酸构建体选自病毒载体或质粒载体。更进一步地，所述CTLA-4基因干扰核酸构建体选自慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、AAV。本专利技术的CTLA-4基因干扰慢病毒载体是将编码前述CTLA-4基因shRNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含：a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CTLA‑4基因杂交的核苷酸序列；或者b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CTLA‑4基因杂交的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含：a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CTLA-4基因杂交的核苷酸序列；或者b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CTLA-4基因杂交的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述CTLA-4基因来源于人。3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CTLA-4基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CTLA-4基因中的靶序列基本相同。4.根据权利要求1～3任一权利要求所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述CTLA-4基因中的靶序列选自如SEQIDNO：1～134所示之任一序列或如SEQIDNO：1～134所示之任一序列经过取代、缺失或添加一个或几个碱基序列且具有与如SEQIDNO：1～134所示之任一序列相同活性的序列。5.根据权利要求1～3任一权利要求所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQIDNO：135～268任一序列所示。6.根据权利要求1～3任一权利要求所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO:269～402任一序列所示。7.一种CTLA-4基因干扰核酸构建体，含有编码如权利要求1～6任一权利要求所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。8.如权利要求7所述的CTLA-4基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述CTLA-4基因干扰核酸构建体选自病毒载体或质粒载体。9.如权利要求8所述的CTLA-4基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述CTLA-4基因干扰核酸构建体选自慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、AAV。10.如权利要求9所述的CTLA-4基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述慢病毒载体选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-Tag...

【专利技术属性】
技术研发人员：林菊芳，廖敬礼，袁纪军，李宗然，张秀，石钰，
申请(专利权)人：上海吉倍生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31