小RNA组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用制造技术

本发明专利技术涉及小RNA组成的指纹图谱在人膀胱癌诊断中的应用，由数个miRNA组成的指纹图谱能够非常有效地区分膀胱癌组织和癌旁组织，灵敏度高，特异性强，可有效用于膀胱癌诊断。

【技术实现步骤摘要】
小RNA组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用
本专利技术涉及生物医学、生物工程和检测
，具体地，涉及一组小RNA指纹图谱及其在人膀胱癌诊断中的用途。
技术介绍
膀胱癌(CarcinomaofBladder；Bladdercancer)是泌尿系统常见的恶性肿瘤,发病以男性为主,其发病率居男性肿瘤发病率的第4位,发病率仅次于前列腺癌；死亡率居男性肿瘤的第9位,男性发病率是女性的14倍。在中国，膀胱癌在男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中居首位,且近年来有逐年增加的趋势。原发膀胱肿瘤绝大多数来自于上皮组织，其中约90％-95％为尿路上皮细胞癌(Urothelialcellcarcinoma,UCC),鳞状细胞癌(3％-7％)与腺癌(2％)相对较少。虽然近年来研究报道了一系列尿液生物标志物可能对膀胱癌的早期诊断、预后复发以及治疗有所帮助，但是目前临床上诊断的金标准还是以尿脱落细胞学检查、膀胱镜检及组织活检为主。尿脱落细胞学检查特异性高，但灵敏度低；而膀胱镜是有创检查，不能早期诊断且患者依从性差。因此，寻找一种简单、经济、非创伤性、灵敏度高的检测方法用于诊断膀胱癌、监测膀胱肿瘤的复发和判断预后就变得很有必要。最近几年，非编码RNA(non-codingRNA)引起生物学界的高度关注，包括siRNA、PiRNA、lncRNA和miRNA。MicroRNA(小RNA，miRNA)是一类长度约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，调节约60％的人类编码基因，在生长、分裂、分化、发育、凋亡及疾病的发生等众多生物学活动中起着极其重要的作用。研究发现miRNA广泛存在于肿瘤细胞中，参与着肿瘤的发生，转移及浸润。且大量研究表明，miRNA的表达无论是在组织、血清还是在尿液中均可以稳定表达。目前，文献报道指出，miR-145，miR-143和miR-125b作为抑癌基因在膀胱癌组织样本中表达降低，同时作为促癌基因的miR-183，miR-96、miR-17-5p和miR-20a则在膀胱癌组织中过表达(HirofumiYoshino,.NatureReviewsUrology10,2013,396-404)。因此，深入挖掘膀胱癌发病机理相关miRNAs，并阐明其作用机制和临床意义，对于指导膀胱癌诊断治疗以及膀胱肿瘤复发监测具有重要的指导意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供有效的小RNA指纹图谱，用于诊断膀胱癌以及检测膀胱肿瘤的复发。本专利技术的第一方面，提供一种miRNA集合或组合，所述的miRNA集合或组合为：(a)序列如SEQIDNO:1-31所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；(b)与SEQIDNO:1-31所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合；或(c)至少一种来自序列如SEQIDNO:1-31所示的miRNA与至少一种来自与SEQIDNO:1-31所示序列互补的miRNA构成的组合，其中来自序列如SEQIDNO:1-31所示的miRNA的序列与来自与SEQIDNO:1-31所示序列互补的miRNA的序列互相不为互补。在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由如SEQIDNO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27所示的序列中3-5种miRNA所构成。在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由如SEQIDNO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27所示的序列中3种或4种miRNA所构成。在另一优选例中，来源于SEQIDNO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27组成的如表4所示的10组miRNA指纹图谱能够非常准确的区分膀胱癌组织和正常(癌旁)组织，满足膀胱癌诊断的临床检验要求。在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达获得。本专利技术的第二方面，提供一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成第一方面所述的miRNA集合或组合中的miRNA。本专利技术的第三方面，提供一种分离的多核苷酸集合或组合，所述的多核苷酸集合或组合中的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成第一方面所述miRNA集合或组合中的miRNA；较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：Seq正向-X-Seq反向式I，式I中，Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。本专利技术的第四方面，提供一种载体，它含有第一方面所述的miRNA集合或组合，或第三方面所述的多核苷酸集合或组合。本专利技术的第五方面，提供一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQIDNO:1-31所示的部分或全部序列。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQIDNO:1-3所示的全部序列。在另一优选例中，所述的特异性地对应指的是所述的寡核苷酸探针上的序列分别与SEQIDNO.:1-31所示的序列互补或基本互补；或分别与SEQIDNO.:1-31所示序列相同。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：互补结合区；和/或与固相载体相连的连接区。本专利技术的第六方面，提供第一方面所述miRNA集合或组合、和/或第五方面所述miRNA芯片的用途，用于制备区分膀胱癌组织和癌旁组织的芯片或试剂盒。本专利技术的第七方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒中含有第五方面所述的miRNA芯片；和/或检测第一方面所述miRNA集合或组合的试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有本专利技术第一方面所述的miRNA集合或组合用于阳性对照。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括说明书，所述的说明书记载了利用本专利技术miRNA芯片对SEQIDNO.:1-31所示部分或全部序列进行测试的方法。本专利技术的第八方面，提供一种筛选治疗膀胱癌候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在实验组中，在待测物质存在下培养膀胱癌细胞；并且在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的膀胱癌细胞；(b)测定所述实验组中膀胱癌细胞的miRNA的表达水平，并与对照组中膀胱癌细胞的miRNA的表达水平进行比较；其中，如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miRNA的表达水平发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是抗膀胱癌的候选药物。在另一优选例中，所述的miRNA为第二方面所述的miRNA集合或组合。在另一优选例中，所述的“发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化”指指对于某一miRNA而言，满足下式：Q≤0.6其中，Q＝abs(A1-A0)/abs(A2-A0)式中，A0为癌旁细胞中所述miRNA表达水平；A1为实验组的所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA集合或组合，其特征在于，所述的miRNA集合或组合为：(a)序列如SEQ ID NO:1‑31所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；(b)与SEQ ID NO:1‑31所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合；或(c)至少一种来自序列如SEQ ID NO:1‑31所示的miRNA与至少一种来自与SEQ ID NO:1‑31所示序列互补的miRNA构成的组合，其中来自序列如SEQ ID NO:1‑31所示的miRNA的序列与来自与SEQ ID NO:1‑31所示序列互补的miRNA的序列互相不为互补。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA集合或组合，其特征在于，所述的miRNA集合或组合为：(a)序列如SEQIDNO:1-31所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；(b)与SEQIDNO:1-31所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合；或(c)至少一种来自序列如SEQIDNO:1-31所示的miRNA与至少一种来自与SEQIDNO:1-31所示序列互补的miRNA构成的组合，其中来自序列如SEQIDNO:1-31所示的miRNA的序列与来自与SEQIDNO:1-31所示序列互补的miRNA的序列互相不为互补。2.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述miRNA集合或组合由如SEQIDNO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27所示的序列中3-5种miRNA所构成。3.一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，其特征在于，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA集合或组合中的miRNA。4.一种分离的多核苷酸集合或组合，其特征在于，所述的多核苷酸集合或组合中的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成权利要求1所述miRNA集合或组合中的miRNA；较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：Seq正向-X-Seq反向式I，式I中，Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭若颖，张奉武，朱苗骏，姜帅，郭剑明，
申请(专利权)人：上海翔琼生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31