一种在同一反应管中通过隔离实现多步骤反应的方法技术

本发明专利技术提供了一种在同一反应管中通过隔离实现多步骤反应的方法。该方法通过使用热熔性隔离层，将可能互相干扰的多步骤反应组分相互隔离，实现在封闭的一管内进行多步骤反应。本发明专利技术的方法隔离率高，重复性好，制备简易，可应用于RT

【技术实现步骤摘要】
一种在同一反应管中通过隔离实现多步骤反应的方法


[0001]本专利技术涉及生物医学、基因工程和检测领域，更具体地涉及一种在同一反应管中通过隔离实现多步骤反应的方法，该方法可应用于RT
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PCR，RT
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qPCR，多重荧光高分辨率溶解曲线(HRM)分析、Taqman蛋白表达量检测，杂交反应、化学发光检测等。

技术介绍

[0002]随着体外诊断检测的发展和普及，对于多个步骤的检测过程在同一反应管中闭管反应的需求越来越高。检测过程的多个步骤在同一反应管中闭管反应可以大大减少检测样品之间的互相污染的可能性，并降低实验室仪器、环境污染的概率。一管内闭管进行多个步骤的反应，可以减少检测人员的操作量和操作时间，大大降低人力成本。
[0003]然而，在同一反应管中进行多个不同步骤的反应，由于不同反应步骤对反应体系中的各种物质的需求的差异，导致同一管中进行多个不同步骤的反应可以应用的范围很窄。目前，在同一反应管中进行多个不同步骤的反应的应用仅限对于mRNA的RT
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qPCR检测，和DNA的预扩增
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qPCR检测。且这两个应用对于两次反应引物设计的要求高，对于可扩增的片段要求，特别是片段的长度要求颇为苛刻，限制了该方法的应用范围。
[0004]随着体外诊断的发展，各种疾病都陆续发现了不少特异性的标记物，特别是一些非编码RNA，尤其是小RNA(Micro RNA)因其与疾病的关联性大，稳定性佳，是一种优秀的疾病标志物。
[0005]MicroRNAs(小RNA)是一类新发现的非编码RNA，它通过序列专一性地结合到和它互补反义的mRNA的3'非编码区(3's UTR)来调控某个或某些目标mRNA转录及稳定性。小RNA在生长、分裂、分化、发育、凋亡及疾病的发生等众多生物学活动中起着极其重要的作用。迄今为止，在人的细胞里，已发现了1800多种小RNA(http://www.mirbase.org/)，这些小RNA参与调控了至少60％人类基因。小RNA是肿瘤分类、疾病诊断、预测及评估预后情况的重要生物学标记。血清或血浆中的与肿瘤相关小RNA已作为肿瘤诊断的生物学标记。小RNA的检测及定量是某些靶基因及通路的发现、疾病机理的研究、药物安全性及功效的评估、疾病诊断及预后评估的重要工具。随着越来越多的非编码RNA的发现，以及这些RNA对于调控和疾病发生的机理越来越明确，且由于小RNA前体在其结合蛋白的保护下，使其不易被降解，相较于mRNA等是更很好的疾病或肿瘤标志物。因此，能够确定各种小RNA在特定细胞中的数量是相当重要的。
[0006]现今，已有多种的小RNA定量分析方法面世，其中包括小RNA芯片矩阵，基于SYBR
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Green I的小RNA定量反转录PCR法(Raymond，C.K.，Roberts，B.S.，Garrett
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Engele，P.，Lim，L.P.，and Johnson，J.M.(2005)Simple，quantitative primer
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extensionPCRassay for direct monitoring ofmicroRNAsand short
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interfering RNAs.RNA 11，)，基于茎状环形的Taqman法(Chen C，Ridzon DA，Broomer AJ，Zhou Z，Lee DH，Nguyen JT，CN 102676637 B BarbisinM，Xu NL，Mahuvakar VR，Andersen MR，Lao KQ，Livak KJ，Guegler KJ.2005.Real
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time quantification of microRNAs by stem
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loop RT
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PCR.NucleicAcids Res33(20)：e179)，基于加PolyA尾的荧光定量PCR检测法(谭若颖，吴鸿菲，龚祖埙，丁航海，CN 102676637)，微珠法及高通量测序等。
[0007]然而，在现有技术中，由于剪切成熟的小RNA的长度仅有20bp左右，几乎所有检测方法均是通过先进行加尾延长RNA后反转录，然后打开反应管，取一部分反应产物加入特异性的正向引物和探针，以及通用的或特异性的反向引物进行下一步的检测。即使对小RNA进行加尾延长，反转录引物与正向引物、反向引物以及探针之间无可避免的会互相重叠，引发严重的非特异性扩增。此外，两步引物之间相互竞争导致特异性扩增效率差，因此目前尚无一管多步骤反应法检测小RNA的方法见诸报道。
[0008]此外，第一步反应完成后需打开反应管，经过稀释，分装入第二次反应体系中的操作，给检测场所、所用的仪器设备带来了极大的污染风险，因此对于需严格管控污染的临床检测实验室或机构几乎不会冒险引入这类检测。
[0009]可见，目前的小RNA定量分析方法存在不足，主要表现在：灵敏度不高、特异性不高，并且容易发生污染。
[0010]因此，本领域迫切需要开发高灵敏度、高特异性，并且可防止交叉污染的检测小RNA定量分析方法。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的就是提供一种高灵敏度、高特异性，并且可防止交叉污染的检测小RNA定量分析方法。本专利技术方法可便捷、有效的在同一反应管中通过隔离实现多步骤反应的方法。
[0012]在本专利技术的第一方面，提供了一种在同一反应容器中通过隔离实现多步骤反应的方法，所述的所述方法包括步骤：
[0013](a)提供多步骤反应所需的全部组分，并将所述全部组分分为组分A和组分B；
[0014](b)使用隔离层将组分A封闭在反应容器中；
[0015](c)向反应容器中加入组分B；
[0016](d)在所述反应容器被封闭的情况下，在低于隔离层物质熔点的温度下，进行第一步反应，从而获得第一步反应产物；
[0017](e)在所述反应容器被封闭的情况下，加热反应管至高于所述隔离层物质熔点的温度，使隔离层物质熔化，从而使所述第一步反应产物与其他组分混合，得到混合物；
[0018](f)对所述混合物进行第二步反应，从而获得第二步反应产物。
[0019]在另一优选例中，所述的全部组分由第一步反应所需的组分和第二步反应所需的组分组成。
[0020]在另一优选例中，所述的步骤(b)中，首先将组分A加入反应管，然后加入隔离层物质形成隔离层，从而将组分A封闭在反应管底部；或
[0021]首先使用隔离层物质包封组分A，然后将包封的组分A加入反应管，从而将组分A封闭在反应管中，形成内含组分A的囊泡形式。
[0022]在另一优选例中，步骤(d)所述的第一步反应可将在隔离层的上方进行，也可在隔离层的下方进行，也可在隔离层的上方和下方同时进行。
[0023]在另一优选例中，步骤(b)所述的隔离层为一层隔离层或多层隔离层。
[0024]在另一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在同一反应容器中通过隔离实现多步骤反应的方法，其特征在于，所述的所述方法包括步骤：(a)提供多步骤反应所需的全部组分，并将所述全部组分分为组分A和组分B；(b)使用隔离层将组分A封闭在反应容器中；(c)向所述反应容器中加入组分B；(d)在所述反应容器被封闭的情况下，在低于隔离层物质熔点的温度下，进行第一步反应，从而获得第一步反应产物；(e)在所述反应容器被封闭的情况下，加热反应管至高于所述隔离层物质熔点的温度，使隔离层物质熔化，从而使所述第一步反应产物与其他组分混合，得到混合物；(f)对所述混合物进行第二步反应，从而获得第二步反应产物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述的隔离层为多层隔离层。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多层隔离层的各层熔点各自独立地选自：50
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52℃、52
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54℃、54
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55℃、56
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58℃、和58
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60℃。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的多层隔离层为双层隔离层，且分别具有52
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54℃与58
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60℃、或50
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52℃与58
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60℃的熔点。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的多层隔离层的各层体积各自独立地选自：5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、和15μL。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的多层隔离层中，第一层(下层)体积为7.5μL，且第二层(上层)体积为10μL或12.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴鸿菲，谭若颖，张奉武，
申请(专利权)人：上海翔琼生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：