特异性识别P53突变的基因系统技术方案

本申请公开了一种特异性识别P53突变的基因系统，包括至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能被野生型P53蛋白特异结合的靶标序列。本发明专利技术的基因系统可以特异性识别并杀死P53缺陷细胞。

【技术实现步骤摘要】
特异性识别P53突变的基因系统
本专利技术涉及领域生物
，具体涉及一种DNA分子以及一种特异性识别P53突变的基因系统。
技术介绍
P53作为一种重要的肿瘤抑制蛋白，在调节细胞正常活动和防止细胞癌变中发挥着核心作用。P53是人类基因组中突变频率最高的基因之一，在人类癌症中有一半以上的癌症细胞发现不同类型的P53突变或缺失，此种改变在肿瘤的形成过程中发挥着极其重要的作用。与正常细胞相比，肿瘤细胞通常缺乏野生型P53蛋白并具有突变型的P53蛋白(1-3)。CRISPR相关(CAS)系统是存在于某些细菌中用于清除外来的遗传物质的特殊系统。作为II型CRISPR系统中最具有特征性的成员，核酸酶Cas9可在单引导RNA(sgRNA)的引导下，广泛地运用于哺乳动物细胞中进行双链DNA切割以及基因敲除(4-6)。白喉毒素(DT)是一种由白喉棒状杆菌分泌的能使细胞死亡并引起“白喉”症状的致病蛋白质(7)。完整的DT是含有大量精氨酸的多肽链，通过蛋白酶的作用后可水解成A、B两个片段，片段A是白喉毒素的主要致病部分，具有酶活性，能使真核细胞中的延伸因子(EF-2)失活而阻碍细胞内蛋白质的合成，从而导致了细胞死亡，片段B能被对白喉毒素敏感的细胞的细胞膜上特定的表面受体所识别(8)。白喉毒素选择性地在肿瘤细胞内表达将发挥杀死细胞的作用，将是治疗肿瘤的一种新的有效策略。参考文献：1.KandothC,McLellanMD,VandinF,YeK,NiuB,LuC,etal.Mutationallandscapeandsignificanceacross12majorcancertypes.Nature.2013；502(7471):333-9.2.HainautP,PfeiferGP.SomaticTP53MutationsintheEraofGenomeSequencing.ColdSpringHarborperspectivesinmedicine.2016；6(11).3.VousdenKH,LuX.Liveorletdie:thecell'sresponsetop53.NaturereviewsCancer.2002；2(8):594-604.4.MaliP,YangL,EsveltKM,AachJ,GuellM,DiCarloJE,etal.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science(NewYork,NY).2013；339(6121):823-6.5.RanFA,HsuPD,WrightJ,AgarwalaV,ScottDA,ZhangF.GenomeengineeringusingtheCRISPR-Cas9system.Natureprotocols.2013；8(11):2281-308.6.FarzadfardF,PerliSD,LuTK.TunableandmultifunctionaleukaryotictranscriptionfactorsbasedonCRISPR/Cas.ACSsyntheticbiology.2013；2(10):604-13.7.HadfieldTL,McEvoyP,PolotskyY,TzinserlingVA,YakovlevAA.Thepathologyofdiphtheria.TheJournalofinfectiousdiseases.2000；181Suppl1:S116-20.8.PappenheimerAM,Jr.Diphtheriatoxin.Annualreviewofbiochemistry.1977；46:69-94.
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种可以用于探测P53突变的基因系统，进一步地，提供一种可以特异性识别并杀死P53缺陷细胞的基因系统。因此，在第一方面，本专利技术提供一种DNA分子，所述DNA分子具有SEQIDNO.1所述的序列，或者所述DNA分子具有与SEQIDNO.1互补的序列。在本专利技术的另一面，本专利技术提供一种特异性识别P53突变的基因系统，所述基因系统包括至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能被野生型P53蛋白特异结合的靶标序列，所述靶标序列具有如SEQIDNO.1所示的序列。具体的，所述系统还包括有基因启动子序列，所述基因启动子序列位于靶标序列的下游。在本专利技术优选的实施方式中，所述基因启动子为SV40启动子。在本专利技术进一步优选的实施方式中，所述基因系统还含有CRISPR-Cas9调控序列，所述CRISPR-Cas9调控序列通过SV40启动子启动表达。具体的，所述CRISPR-Cas9调控序列包括Cas9蛋白的DNA序列及可经转录成为sgRNA的DNA序列，所述sgRNA的靶向基因为编码细胞毒性蛋白的基因。在本专利技术优选的实施方式中，所述基因系统还包括编码细胞毒性蛋白的基因表达系统，所述表达系统包括启动子和编码细胞毒性蛋白的基因。在本专利技术中，所述编码细胞毒性蛋白优选为白喉毒素(DT)，并且，由于DT的两个蛋白片段A、B中，片段A是白喉毒素的主要致病部分，而片段B并不直接导致细胞死亡，因此，在本专利技术中，细胞毒性蛋白至少包括白喉毒素的片段A即可，也就是说，本专利技术的细胞毒性蛋白可以是完整的白喉毒素，也可以仅包括白喉毒素的片段A。编码细胞毒性蛋白的基因启动子优选为hEF1a启动子。在本专利技术中，所述白喉毒素或白喉毒素A蛋白的表达系统，与由SV40启动表达的CRISPR-Cas9调控序列表达系统，可以分属于不同的表达系统，分别进行表达，也可以位于同一个表达系统中表达，两者效果相当。在本专利技术具体的实施方式中，所述sgRNA的序列靶标白喉毒素的片段如SEQIDNO.2所示。在本专利技术优选的实施方式中，CRISPR-Cas9调控序列的结构如图1A所示，Cas9蛋白的DNA序列两端连接有核定位序列NLS；可经转录成为sgRNA的DNA序列两侧连接有核酶(ribozyme)结构；Cas9蛋白的DNA序列及可经转录成为sgRNA的DNA序列之间，还具有三螺旋结构(Triplex)，优选的，所述三螺旋结构的序列具有如SEQIDNO.3所示的序列。本专利技术的有益效果：本专利技术的特异性识别P53突变的基因系统，能有效识别细胞的P53蛋白，并可以实现选择性地使细胞毒性蛋白在P53缺陷细胞中表达，从而达到选择性杀死P53缺陷细胞，并保证正常细胞免收细胞毒性蛋白的损害。而与正常细胞相比，由于肿瘤细胞通常缺乏野生型P53蛋白并具有突变型的P53蛋白，因此，利用本专利技术，有望实现白喉毒素或类似的细胞毒性蛋白在肿瘤细胞内的选择性表达，并发挥选择性杀死肿瘤细胞而使正常细胞免收伤害，从而成为治疗肿瘤的一种新的有效策略。附图说明图1是本专利技术的同一启动子表达CRISPR系统的示意图。图2是根据本专利技术实施例，在P53BER-SV40下游连接绿色荧光蛋白(GFP)，通过比较GFP在正常细胞系和P53缺陷细胞系中的表达情况以验证P53BER-SV40这一识别P53蛋白的基因装置的实用性的结果图，并使用有hEF1a启动子表达的远红色荧光蛋白(mKate)作为内参。将构建好的质粒转染进293T和5637细胞中，在mKa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子具有SEQ ID NO.1所述的序列，或者所述DNA分子具有与SEQ ID NO.1互补的序列。

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子具有SEQIDNO.1所述的序列，或者所述DNA分子具有与SEQIDNO.1互补的序列。2.一种特异性识别P53突变的基因系统，其特征在于：所述基因系统包括至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能被野生型P53蛋白特异结合的靶标序列，所述靶标序列具有如SEQIDNO.1所示的序列。3.根据权利要求2所述的一种特异性识别P53突变的基因系统，其特征在于：所述系统还包括有基因启动子序列，所述基因启动子序列位于靶标序列的下游。4.根据权利要求3所述的一种特异性识别P53突变的基因系统，其特征在于：所述基因启动子为SV40启动子。5.根据权利要求3或4所述的一种特异性识别P53突变的基因系统，其特征在于：所述基因系统还含有CRISPR-Cas9调控序列，所述CRISPR-Cas9调控序列通过SV40启动子启动表达。6.根据权利要求5所述的一种特异性识别P53突变的基因系统，其特征在于：所述CRISPR-Cas9调控序列包括Cas9蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄卫人，刘宇辰，詹恒基，蔡志明，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东,44