干细胞聚集体的群体的制备方法技术

本发明专利技术是聚集体形成方法。上述方法中分别在二个以上分区(32a)、(32b)分配二个以上细胞块(42a)‑(42c)。在各分区(32a)、(32b)内使二个以上细胞块(32a)、(32b)彼此靠近。使彼此靠近的二个以上细胞块(42a)、(42b)聚集。培育聚集的细胞块而形成聚集体。分配的细胞块(42a)‑(42c)彼此分离并彼此混合。细胞块(42a)‑(42c)分别由干细胞构成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】干细胞聚集体的群体的制备方法
本专利技术涉及干细胞聚集体的群体的制备方法。
技术介绍
已知使多能干细胞聚集而形成类胚体的方法(专利文献1)。上述方法中针对类胚体(EB,embryoidbody)使用酶而使细胞实质上个体化(权利要求9)。使个体化的细胞再聚集(权利要求18)。上述方法适于将多能干细胞分化为内皮细胞。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2012-519005号公报非专利文献非专利文献1：KenjiOsafune,LeslieCaron,MalgorzataBorowiak,RitaJMartinez,ClaireSFitz-Gerald,YasunoriSato,ChadACowan,KennethRChien&DouglasAMelton,"Markeddifferencesindifferentiationpropensityamonghumanembryonicstemcelllines",NatureBiotechnology,Publishedonline:17February2008,26,313-315
技术实现思路
专利技术要解决的问题上述方法中为了准备大量的类胚体而对类胚体进行破碎而形成多个细胞块，分别对上述细胞块进行培育而成为新的类胚体。然而，通常类胚体中还包含已经开始进行分化的细胞。因此，上述方法作为实质上保持多能干细胞聚集体的未分化状态而增加多能干细胞聚集体的方法是不适合的。专利技术人等在专利技术的过程中得到了以下见解。非专利文献1显示了由于细胞的培养时期不同而分化的进度不同(非专利文献1的补充图1.)。若对分化进度不同的细胞直接进行传代，则分化的进度被传代后所形成的聚集体继承。因此可预料到每重复进行1次传代，就使聚集体之间的未分化状态的均质性降低。可认为其原因在于，由于聚集体的大小不同而分化、未分化的方向性发生变化。另外，作为出现上述现象的理由，可认为由于细胞生存所需的营养没有适宜地扩散至聚集体内部，因此对于聚集体的中心部没能供给上述营养。另外，未进行气体、无用物质的扩散也会阻碍聚集体的内部的细胞的生存。另外聚集体变得过大时，不仅从内部分化，还有引起细胞死亡的担心。另一方面，若聚集体一直较小则扩大培养的效率差。因此，专利技术人等认为使聚集体的大小保持一定大小，并使进行传代的时机一致对于制备未分化细胞聚集体而言是重要的。本专利技术基于上述见解以在制备干细胞聚集体的群体时提高聚集体之间的未分化状态的均质性作为课题。用于解决问题的方案[1]一种干细胞聚集体的群体的制备方法，其为如下方法：分别在二个以上彼此大小均等的分区分配二个以上细胞块，使前述二个以上细胞块在各前述分区内彼此靠近，使前述彼此靠近的二个以上细胞块聚集并进行培育而形成聚集体，前述分配的前述细胞块彼此分离并彼此混合，前述细胞块分别由干细胞构成。[2]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，分解前述形成的聚集体而生成细胞块，使由不同的前述聚集体生成的前述细胞块彼此混合，分别在二个以上分区分配二个以上前述混合的细胞块，使前述二个以上混合的细胞块在各前述分区内彼此靠近，使前述彼此靠近的二个以上细胞块再次聚集。[3]根据[2]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，在前述聚集体的直径为1mm以下的时刻分解前述聚集体。[4]根据[2]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，进行前述培育时，将前述聚集体培育2天以上且14天以下的时间。[5]根据[2]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，进行前述培育时，将前述聚集体培育3天以上且7天以下的时间。[6]根据[2]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，进一步重复1次或2次以上如下过程：分解前述聚集体、混合前述细胞块、使其靠近、分配并再次聚集。[7]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，对前述干细胞进行平板培养而形成集落，分解前述集落而生成前述细胞块，将前述生成的前述细胞块彼此混合，将前述细胞块用于前述分配。[8]根据[7]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，通过物理破碎对前述集落进行前述分解，对前述集落不进行酶处理。[9]根据[7]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，仅通过酶处理对前述集落进行前述分解，对前述集落不进行物理破碎。[10]根据[7]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，分解前述集落时，对前述集落进行酶处理和物理破碎。[11]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述分区由平板所具有的孔形成，前述孔为贯通孔或凹部，前述孔在前述平板所具有的顶面侧具有顶部开口，前述顶部开口在前述分区间具有彼此相等的面积，前述顶部开口的直径为1.5mm以下。[12]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述分区由平板所具有的贯通孔形成，前述贯通孔在前述平板所具有的底面侧具有底部开口，底部开口的直径为1mm以下，通过使前述聚集体通过前述底部开口来从前述平板回收前述聚集体。[13]根据[12]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述细胞块是在配置于前述分区中的培养液中被培养的，前述培养液形成液滴，前述液滴附着在前述底部开口并以从前述底部开口垂下的方式突出，前述分区的底面由前述液滴的弯液面形成。[14]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述分区的内切球的直径为5×101μm以上且1×103μm以下，前述内切球与前述分区所具有的底面相切。[15]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述细胞块是在配置于前述分区中的培养液中被培养的，前述培养液介由前述分区的顶部与配置于储存分区中的培养液连接，前述储存分区的前述培养液中未配置细胞。[16]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述分区由平板所具有的孔形成，前述孔为贯通孔或凹部，前述孔在前述平板所具有的顶面侧具有顶部开口，进行前述分配时，用前述细胞块的悬浮液覆盖前述顶面。[17]根据[16]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述悬浮液中包含相对于前述顶面的单位面积(1cm2)为1个以上且5000个以下的细胞块。[18]根据[1]所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，前述细胞块是在配置于前述分区中的培养液中被培养的，前述培养液中悬浮或溶解有细胞外基质。[19]一种细胞培养方法，其为如下方法：由干细胞形成聚集体，边对前述聚集体进行悬浮培养或贴壁培养边使前述干细胞分化，形成前述聚集体时，分别在二个以上彼此大小均等的分区分配二个以上细胞块，使前述二个以上细胞块在各前述分区内彼此靠近，使前述彼此靠近的二个以上细胞块聚集并进行培育而形成聚集体，在前述分配前使前述细胞块彼此分离并彼此混合，前述细胞块分别由干细胞构成。[20]根据[19]所述的细胞培养方法，其中，进一步在前述分区内，使前述聚集体中的细胞分化为外胚层、中胚层和内胚层中的任一种。[21]一种聚集体的群体，其中，从前述群体中选择1个前述聚集体；从前述选择的聚集体中选择10个以上细胞；通过对前述10个以上细胞判定Nanog、Oct3/4和TRA-1-60中的至少任一个多能干细胞标记物是否为阳性来测量阳性率；对所述群体进行3次上述阳性率的测量时；3次的阳性率的平均值本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞聚集体的群体的制备方法，其为如下方法：分别在二个以上彼此大小均等的分区分配二个以上细胞块，使所述二个以上细胞块在各所述分区内彼此靠近，使所述彼此靠近的二个以上细胞块聚集并进行培育而形成聚集体，所述分配的所述细胞块彼此分离并彼此混合，所述细胞块分别由干细胞构成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.29 US 62/272,5241.一种干细胞聚集体的群体的制备方法，其为如下方法：分别在二个以上彼此大小均等的分区分配二个以上细胞块，使所述二个以上细胞块在各所述分区内彼此靠近，使所述彼此靠近的二个以上细胞块聚集并进行培育而形成聚集体，所述分配的所述细胞块彼此分离并彼此混合，所述细胞块分别由干细胞构成。2.根据权利要求1所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，分解所述形成的聚集体而生成细胞块，使由不同的所述聚集体生成的所述细胞块彼此混合，分别在二个以上分区分配二个以上所述混合的细胞块，使所述二个以上混合的细胞块在各所述分区内彼此靠近，使所述彼此靠近的二个以上细胞块再次聚集。3.根据权利要求2所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，在所述聚集体的直径为1mm以下的时刻分解所述聚集体。4.根据权利要求2所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，进行所述培育时，将所述聚集体培育2天以上且14天以下的时间。5.根据权利要求2所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，进行所述培育时，将所述聚集体培育3天以上且7天以下的时间。6.根据权利要求2所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，进一步重复1次或2次以上如下过程：分解所述聚集体、混合所述细胞块、使其靠近、分配并再次聚集。7.根据权利要求1所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，对所述干细胞进行平板培养而形成集落，分解所述集落而生成所述细胞块，将所述生成的所述细胞块彼此混合，将所述细胞块用于所述分配。8.根据权利要求7所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，通过物理破碎对所述集落进行所述分解，对所述集落不进行酶处理。9.根据权利要求7所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，仅通过酶处理对所述集落进行所述分解，对所述集落不进行物理破碎。10.根据权利要求7所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，分解所述集落时，对所述集落进行酶处理和物理破碎。11.根据权利要求1所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，所述分区由平板所具有的孔形成，所述孔为贯通孔或凹部，所述孔在所述平板所具有的顶面侧具有顶部开口，所述顶部开口在所述分区间具有彼此相等的面积，所述顶部开口的直径为1.5mm以下。12.根据权利要求1所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中，所述分区由平板所具有的贯通孔形成，所述贯通孔在所述平板所具有的底面侧具有底部开口，底部开口的直径为1mm以下，通过使所述聚集体通过所述底部开口来从所述平板回收所述聚集体。13.根据权利要求12所述的干细胞聚集体的群体的制备方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：田边刚士，须藤健太，
申请(专利权)人：株式会社可乐丽，爱平世，
类型：发明
国别省市：日本,JP