孕甾烷糖苷类化合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种孕甾烷糖苷类化合物及其在制备免疫抑制药物和抗炎药物中的应用；该化合物是从思茅藤属植物中提取分离得到的，其结构式如下式所示：

Steroidal glycosides and their applications

The invention discloses a pregnane glycoside compound and its application in the preparation of immunosuppressive drugs and anti-inflammatory drugs; the compound is isolated from the plant of the genus Simaoteng, and its structural formula is as follows:

【技术实现步骤摘要】
孕甾烷糖苷类化合物及其应用
本专利技术涉及一种孕甾烷糖苷化合物及其在制备免疫抑制药物、抗炎药物中的应用。
技术介绍
免疫抑制剂在临床为自身免疫病和器官移植后的排斥反应提供了有效的治疗药物，通常用来抑制器官移植后出现的排异反应，治疗骨髓移植后出现的移植物抗宿主病，或治疗类风湿性关节炎、克隆氏症等自身免疫性疾病。抗炎药是用于治疗组织受到损伤后所发生的反应炎症的药物；甾体类药物是临床常用的免疫抑制剂和抗炎药物，如泼尼松、地塞米松、甲泼尼龙等。它能有效抑制炎症因子，减少各种免疫细胞。现有的如糖皮质激素之类的甾体抗炎药物和免疫抑制剂长期用药普遍存在产生耐药性、毒副作用大、使用不方便等缺点，因此一般仅在重大疾病的治疗中使用。中药作为一种天然产物，具有与人组织相容性质好、副作用小等优点，在免疫抑制剂和抗炎制剂的研究中越来越受到人们的重视。因而，从天然产物中寻找具有免疫抑制和抗炎作用的化合物，对于开发高效低毒的新型免疫抑制剂和抗炎药物具有应用价值。思茅藤属(Epigynum)是夹竹桃科思茅藤族的一个属，根据我们前期的研究结果，思茅藤属植物中富含雄甾烷、孕甾烷及其糖苷类物质。本专利技术提供的孕甾烷糖苷化合物及其作为免疫抑制药物和抗炎药物目前尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种结构式如式Ⅰ所示的孕甾烷糖苷类化合物：R1,R2均选自糖基。上述糖基是指2,3-甲氧基-6-去氧-β-D-艾杜糖和2,6-二去氧-β-D-吡喃阿拉伯己糖；分别位于R1和R2位置。本专利技术另一目的是提供结构式如式Ⅱ所示的孕甾烷糖苷类化合物：式Ⅱ：17α-羟基-孕甾-5(6)-烯-3β-O-2,3-甲氧基-6-去氧-β-D-艾杜糖-20α-O-2,6-二去氧-β-D-吡喃阿拉伯己糖苷，通俗名epigycosideB。本专利技术的另一目的是将上述孕甾烷糖苷化合物应用在制备免疫抑制药物中。具体免疫抑制药物应用在制备自身免疫性疾病的治疗药物中，或应用在制备器官移植抗排斥反应的治疗药物中。本专利技术另一目的是将上述孕甾烷糖苷类化合物应用在制备抗炎药物中。本专利技术所述应用中还可以药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。本专利技术所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。本专利技术中用健康的Balb/c小鼠来制备脾细胞用于试验；脾细胞制备完成后，通过ConA或者LPS进行诱导，同时在试验组加入不同浓度供试化合物，以对应浓度的地塞米松(Dexamethasone，简称DXMS)作为阳性对照，培养72h后，通过CellCountingKit-8(CCK-8)试剂法分别测定试验组、阳性对照组、诱导对照组和未诱导对照组的吸光值，从而评价化合物调节T细胞或者B细胞增殖的能力；实验结果表明本专利技术中孕甾烷糖苷类化合物epigycosideB对ConA或LPS刺激的Balb/c小鼠T脾淋巴细胞或B淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用，与不加该化合物的对照组相比有显著性差异(p<0.05)。本专利技术中使用LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)作为炎症模型，RAW264.7细胞生长状态稳定后，在试验组加入不同浓度的供试化合物，以对应浓度的地塞米松为阳性对照，继续孵育2h加入LPS诱导RAW264.7细胞发生炎症反应，继续培养24h，收集培养基上清进行使用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)以及前列腺素E2(PGE2)三种炎症因子的表达水平；以此评价化合物的体外抗炎活性；实验结果表明本专利技术中孕甾烷糖苷类化合物epigycosideB对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的TNF-α、IL-1β以及PGE2三种炎症因子的表达水平都具有明显的抑制作用，与不加该化合物的对照组具有显著性差异(p<0.05)。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。实施例1：EpigycosideB的制备将缅甸思茅藤(Epigynumcochinchinensis)枝叶分捡，所得叶5kg于干燥通风处自然晾干后，使用打粉机打成碎片；缅甸思茅藤叶碎片浸没于10L体积浓度75％甲醇溶液中浸渍提取，每次12小时，连续浸提三次；收集合并浸提液，使用旋转蒸发仪减压浓缩除去液体，得到浸膏500g；浸膏加2L水溶解后置于分液漏斗，再加等体积乙酸乙酯进行反复萃取；多次萃取至乙酸乙酯层几近无色，收集合并乙酸乙酯层蒸干后获得粗提物浸膏120g；使用中压色谱分离系统将粗提物过MCI柱，经体积浓度90％甲醇水冲洗5个柱体积获得不含植物色素等杂质的样品，100％甲醇冲洗所得之色素等杂质弃掉；最终获得后续可分离总样品60g。经乙酸乙酯萃取并除去色素后获得总样品60g，100gC18填料拌样后，使用中压色谱进行分离，依次用体积浓度20％甲醇水、40％甲醇水、60％甲醇水、80％甲醇水和100％甲醇水梯度冲洗，每个梯度冲洗10L流动相。每个浓度冲洗所得样品单独保存，分别标记为Fr.A(10g)、Fr.B(10g)、Fr.C(14g)、Fr.D(12g)、Fr.E(12g)。Fr.D(12g)部分使用C18中压柱以甲醇水(40:60-80:20)每10％比例变换进行梯度洗脱，洗脱液300mL每份进行收集，得到FrD1、D2、D3、D4、D5等5个部分。Fr.D1(2.1g)部分进行硅胶柱层析分离，以氯仿：丙酮(10:1-2:1)体系梯度冲柱，每150mL洗脱液分别收集，结合TLC检测合并相同组分的收集液，TLC检测分析后，最终保留3个部分，Fr.D1-1，Fr.D1-2，Fr.D1-3；其中Fr.D1-1经过凝胶柱使用甲醇进行洗脱纯化处理，最终获得单体化合物epigycosideB(3.5mg)；经鉴定本专利技术孕甾烷糖苷化合物epigycosideB为新化合物；鉴定结果如下：式Ⅱ化合物epigycosideB为白色不定型粉末，易溶于氯仿、甲醇等溶剂。[α](c0.1,CH3OH)；UV(CH3OH)λmax(logε):203nm(3.5)；IR(KBr)vmax:3450,2922,2853,1638,1535,1401,1384,1202,1034cm–1；(+)HR-ESI-MSm/z661.3920[M+Na]+(calcd.forC35H58O10Na+,661.3922).1HNMR(methanol-d4,600Mz)和13CNMR(methanol-d4,150Mz)见表1；以上数据结合2DNMR分析证实了该化合物的化学结构式为式Ⅱ中所示，为一个新的天然有机化合物，命名为epigycosideB。表1：EpigycosideB1HNMR和13CNMR数据aov:overlap。实施例2：免疫抑制检测试验(1)脾淋巴细胞悬液的制备取18～22g的健康BABL/c小鼠摘除眼球放血后脱颈处死，置于体积浓度75％酒精中浸泡消毒3-5分钟，取出置于无菌托盘本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.结构式如下式所示的孕甾烷糖苷类化合物：

【技术特征摘要】
1.结构式如下式所示的孕甾烷糖苷类化合物：其中，R1、R2均选自糖基。2.根据权利要求1所述的孕甾烷糖苷类化合物，其特征在于，化合物结构式如...

【专利技术属性】
技术研发人员：程桂广，邵玉亭，曹建新，蒋孟君，姚元成，赵天瑞，张宏，赵燕，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53