蛋白S作为生物标志物在制备哮喘疾病诊断和预后效果评价试剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，公开了蛋白S（Protein S,Pros1）作为生物标志物在制备哮喘疾病诊断和预后效果评价试剂中的应用。申请人发现在哮喘患者的外周血中的Pros1的RNA水平显著高于健康人；进一步的，对轻症和重症哮喘患者和健康人的外周血中的Pros1进行ELISA检测，发现在重症哮喘患者的外周血中Pros1的蛋白水平显著高于健康人；同时在哮喘患者中，处于急性期的患者比处于缓解期的患者外周血中Pros1的蛋白水平更高，因此蛋白S可作为生物标志物用于哮喘疾病诊断和预后效果评价。

Application of protein S as biomarker in preparation of reagents for diagnosis and prognosis of asthma diseases

The invention relates to the field of biomedicine and discloses the application of protein S (Pros1) as a biomarker in the preparation of diagnostic and prognostic reagents for asthmatic diseases. The applicant found that the level of Pros1 RNA in the peripheral blood of asthmatic patients was significantly higher than that of healthy people; furthermore, the level of Pros1 protein in the peripheral blood of mild and severe asthmatic patients and healthy people was detected by ELISA, and the level of Pros1 protein in the peripheral blood of severe asthmatic patients was significantly higher than that of healthy people. The level of Pros1 protein in peripheral blood of patients in acute phase is higher than that of patients in remission phase, so protein S can be used as a biomarker in the diagnosis and prognosis evaluation of asthma.

【技术实现步骤摘要】
蛋白S作为生物标志物在制备哮喘疾病诊断和预后效果评价试剂中的应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，涉及蛋白S(ProteinS,Pros1)作为生物标志物在制备哮喘疾病诊断和预后效果评价试剂中的应用。
技术介绍
哮喘是最常见的慢性免疫性疾病之一，影响人群覆盖各个年龄段，被称为严重危害人类生存质量的四大杀手之一，仅次于艾滋病、肿瘤和心脑血管疾病。全世界约有3亿人患有哮喘，每年至少有25万人死于哮喘相关疾病。近年来，随着空气污染和环境恶化，哮喘的发病率逐年上升。目前我国哮喘的现状是患病率还比较低，但患病率增长速度非常快。中国哮喘联盟2013年一项覆盖全国7个大区8个省市、样本量超过16万人的流行病学调查显示，我国哮喘总患病率为1.24％。北京地区和上海地区较10年前的调查结果分别增高了147.9％和190.2％。哮喘症患者群体越来越大，催生出了巨大的药物市场。根据病情严重程度，可将哮喘分为轻症哮喘和重症哮喘。而哮喘根据是否急性发作可分为急性期和缓解期，急性期患者由于支气管平滑肌痉挛导致气道狭窄，出现喘息、呼吸困难的症状，经过治疗症状明显缓解或消失后进入缓解期。缓解期患者仍存在气道炎症和高反应的问题，如不能有效控制，长期下去就会造成气道的不可逆重建，导致肺功能的永久性损害。因而精准地诊断疾病的严重程度和所处时期，对症用药，对哮喘的治疗意义重大。一直以来，人们致力于寻找用于哮喘疾病诊断或者预后效果评价的标志物，然而已有的一些检测手段要么取样困难，要么彼此之间相关性差，临床上仍期待好的生物标志物的出现。我们通过筛选发现了一种潜在的生物标志物Pros1。Pros1最早是作为一种新型维他命K依赖的糖蛋白于20世纪70年代被人们发现。该蛋白是一种天然存在的抗凝剂，具有多种生物功能，可参与细胞增殖、细胞凋亡、凝血反应、调节炎症因子释放、血管生成和肿瘤发生等生理反应，到目前为止还没有人发现过Pros1与哮喘的关系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了检测Pros1基因或蛋白S的试剂在制备哮喘疾病诊断药物中的应用。本专利技术的另一个目的在于提供了检测Pros1基因或蛋白S的试剂在制备哮喘预后效果评价药物中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：申请人通过采集哮喘患者和健康人的外周血，提取RNA后，对大量基因进行定量PCR筛选，最终发现在哮喘患者的外周血中Pros1的RNA水平显著高于健康人；进一步的，对轻症和重症哮喘患者和健康人的外周血中的Pros1进行ELISA检测，发现在重症哮喘患者的外周血中Pros1的蛋白水平显著高于健康人；同时在哮喘患者中，处于急性期的患者比处于缓解期的患者外周血中Pros1的蛋白水平更高。检测Pros1基因或蛋白S的试剂在制备哮喘疾病诊断药物中的应用，包括利用本领域的常规手段将上述试剂作为唯一有效成分或与其他有效成分制备成对哮喘疾病进行诊断的试剂盒；根据上述应用，针对Pros1基因设计的定量PCR引物可用于制备哮喘疾病诊断试剂盒；优选的，所述的引物为：正向引物5'-TGCTGGCGTGTCTCCTCCTA-3'；反向引物5'-CAGTTCTTCGATGCATTCTCTTTCA-3'。检测Pros1基因或蛋白S的试剂在制备哮喘预后效果评价药物中的应用，包括利用本领域的常规手段将上述试剂作为唯一有效成分或与其他有效试剂制备成对哮喘进行预后效果评价的试剂盒。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.Pros1可分泌表达，在血清中为微克级，取样和检测操作简单易行。2.Pros1在小鼠哮喘模型肺泡灌洗液中的蛋白水平和嗜酸性粒细胞的百分数具有显著的相关性，后者为哮喘诊断的金标准，这说明Pros1是非常好的生物标志物。附图说明图1本专利技术实施例1的哮喘患者外周血特异性表达基因的筛选；图2本专利技术实施例2的哮喘患者外周血中Pros1的蛋白水平检测结果；其中A显示了轻症和重症哮喘患者外周血中Pros1的蛋白水平检测结果；B显示了哮喘患者急性期和缓解期外周血中Pros1的蛋白水平检测结果；图3本专利技术实施例3的小鼠哮喘模型中嗜酸性粒细胞和Pros1的相关性分析结果；其中A显示了小鼠哮喘模型肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的百分数结果；B显示了小鼠哮喘模型肺泡灌洗液中Pros1的蛋白水平检测结果；C显示了小鼠哮喘模型肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞和Pros1的相关性分析结果。具体实施方式下面将结合具体实施例详细描述本专利技术的实施例，下面的实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：哮喘患者外周血特异性表达基因的筛选：1.实验材料1.1哮喘患者或健康人外周血细胞人外周血样本由广州市妇女儿童医疗中心(GWCMC)采集。1.2试剂人淋巴细胞分离液Ficol购自GEHealthcare公司，RNAisoPlus购自TAKARA公司，引物委托tsingke公司合成，SYBRGreenRealtimePCRMastermix购自全式金公司。1.3实验仪器定量RCP仪(StratageneMx3000P)购自Agilent公司。2.实验方法与结果2.1外周血样本cDNA的制备(1)采集哮喘患者或健康人外周血,分离外周血单个有核细胞(PBMCs)，重悬于1毫升RNAisoPlus中，冻存于-80℃冰箱。(2)提取样本RNA并反转录得到cDNA。2.2定量PCR(RT-PCR)检测目的基因表达(1)取反转录得到的cDNA，用双蒸水稀释10倍作为PCR反应的模板。取模板5微升，加入15微升引物和2XSYBRGreenmix配制的母液，进行反应，配制方法如下：双蒸水4微升，10毫摩正向引物0.5微升，10毫摩反向引物0.5微升，2XSYBRGreenmix10微升。(2)针对待测基因设计定量PCR引物，选择管家基因GADPH作为校正的内参对照基因，针对人GADPH的定量RCR引物序列如下：正向引物5'-TGCACCACCAACTGCTTA-3'；反向引物5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'。在定量PCR仪上运行程序：94℃30秒；94℃5秒，55℃15秒，72℃20秒，40个循环。生成溶解曲线。(3)定量的Ct值通过内参基因(GAPDH)进行校对，结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。(4)利用步骤(3)中的计算结果绘制哮喘患者外周血中各基因RNA水平检测结果图。最终申请人发现，哮喘患者外周血PBMCs中Pros1的RNA水平显著高于健康人(图1)，因此Pros1基因可用作哮喘诊断的标志物，针对该基因设计的引物或者针对检测该基因的试剂可用于制备成哮喘诊断试剂盒。针对人Pros1基因序列设计定量RCR引物，引物序列如下：正向引物5'-TGCTGGCGTGTCTCCTCCTA-3'；反向引物5'-CAGTTCTTCGATGCATTCTCTTTCA-3'。实施例2：哮喘患者外周血中Pros1的蛋白水平检测：1.实验材料1.1哮喘患者或健康人外周血血清人外周血样本由广州市妇女儿童医疗中心(GWCMC)采集。1.2试剂蛋白S(PROS)检测试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Pros1基因或蛋白S在制备成哮喘诊断标志物中的应用。

【技术特征摘要】
1.Pros1基因或蛋白S在制备成哮喘诊断标志物中的应用。2.检测Pros1基因或蛋白S的试剂在制备哮喘疾病诊断药物中的应用。3.针对Pros1基因设计的定量PCR引物在制备哮喘疾病诊断试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏滨，邓力，程梦兰，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42