本发明专利技术涉及用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物及试剂盒，引物组合物包括CYP2C9引物组、KCNJ11引物组及ABCC8引物组；试剂盒包括上述引物组合物。与现有技术相比，本发明专利技术釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法，得到一种能够快速、敏感而且简便地检测磺酰脲类药物疗效相关基因(CYP2C9、KCNJ11和ABCC8)基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括特异性ARMS检测引物、内控引物及PCR反应液，通过设计ARMS引物以及将Scorpions探针换为SYBR染料，以使检测成本大大降低，更适合中国患者CYP2C9、KCNJ11和ABCC8基因多态性的检测，具有检测快速、灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确的优势，适于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物及试剂盒
本专利技术属于基因检测
，涉及一种用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物及试剂盒。
技术介绍
磺酰脲类药物(sulfonylureas，SU)是治疗2型糖尿病的主要口服药物之一，通过结合磺酰脲类受体使胰岛β细胞钾通道关闭，从而刺激胰岛素分泌。研究发现，磺酰脲类药物的药效个体差异较大，大约10％-20％患者疗效高于平均水平，但仍有10％-20％患者最初服用磺酰脲类药物后治疗失败。有研究指出，发生这种现象多是由于作用于KATP通道的、分别由KCNJ11和ABCC8编码的Kir6.2和SUR1受体以及代谢磺酰脲类药物的CYP2C9发生变异引起的。CYP2C9是CYP450家族中常见的药物酶代谢基因，常见的等位基因以野生型CYP2C9*1和突变型CYP2C9*2和CYP2C9*3最为常见。研究发现，CYP2C9*2的活性仅是正常功能者的40％左右，CYP2C9*3的活性仅是正常功能者的10％，突变患者可使磺酰脲类药物的肾清除率显著降低，其药物半衰期明显延长。磺脲类药物作用于胰岛β细胞膜上的ATP敏感性钾通道(KATP)，从而关闭钾通道，刺激胰岛β细胞释放胰岛素。ATP敏感性钾通道组成：亚基磺脲类受体(SUR)+亚基内向整流钾通道(Kir)。研究发现，编码Kir6.2的基因KCNJ11的E23K多态性可能影响β细胞对磺酰脲类药物的反应，从而减少胰岛素的分泌，增加继发性失效发生的风险。ABCC8基因编码SUR1受体，磺酰脲类药物通过与SUR1受体结合，从而使钾通道关闭，刺激胰岛素的分泌，进而产生降血糖的作用。研究发现，ABCC8基因S1369A位点多态性与磺酰脲类药物的疗效有关，该位点G等位基因携带者对磺酰脲类较为敏感，治疗效果优于T等位基因型携带者。基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究，已经报道的方法包括直接测序法、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、PCR-SSCP/RFLP、ScorpionsARMS、TaqManPCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplificationrefractorymutationsystem，扩增阻滞突变系统)法。其中，直接测序法能够发现一些新的未知突变，但检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列步骤，费时费力。ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性地识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。然而，现在市场上的类似试剂盒价格昂贵，应用受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物及试剂盒。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物，该引物组合物包括CYP2C9引物组、KCNJ11引物组及ABCC8引物组；所述的CYP2C9引物组包括以下引物：P1-FW：5’-AGAGGAGCATTGAGGAAC-3’；P1-FS：5’-AAGAGGAGCATTGAGGACT-3’；P1-R：5’-TAACAACCAGGACTCAT-3’；P2-FW：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’；P2-FS：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’；P2-R：5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’；所述的KCNJ11引物组包括以下引物：P3-F：5’-GCACGGTACCTGGGCAC-3’；P3-RW：5’-GCACGGTACCTGGGCAT-3’；P3-RS：5’-CACCGAGAGGACTCTGCA-3’；所述的ABCC8引物组包括以下引物：P4-FW：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；P4-FS：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；P4-R：5’-ACTGCGATGTCTGAATA-3’。进一步地，该引物组合物还包括内控引物组，该内控引物组包括以下引物：CF：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3’；CR：5’-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3’。所述的引物组合物在制备磺酰脲类药物相关基因的基因多态性检测试剂中的应用。用于检测磺酰脲类药物相关基因的试剂盒，该试剂盒包括所述的引物组合物。进一步地，该试剂盒还包括PCR反应液，该PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq酶、MgCl2、dNTPs及SYBRGreenI染料。所述的PCR缓冲液为Tris-HCl缓冲液、Tris-乙酸(TAE)缓冲液或Tris-硼酸(TBE)缓冲液。作为优选的技术方案，该PCR反应液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶(酶活力为2.5U)、1.0-5.0mMMgCl2、4.0-20.0mMdNTPs(包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP各1.0-5.0mM)及SYBRGreenI染料。进一步地，该试剂盒还包括阳性对照液及阴性对照液。作为优选的技术方案，所述的阳性对照液为含有试剂盒内可检测的4个位点对应的质粒混合液，质粒混合液中含有4种不同的带有待检测突变位点的CYP2C9、KCNJ11和ABCC8等位基因，质粒混合液中的质粒浓度为1000copies/μl；所述的阴性对照液为Tris-HCL缓冲液，该Tris-HCL缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。磺酰脲类药物相关基因(CYP2C9、KCNJ11和ABCC8)的基因多态性检测方法，包括以下步骤：1)待测样品的处理和模板的提取；2)利用所述的引物组合物配制荧光定量PCR反应体系；3)釆用ARMS法，利用各引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreenI染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。作为优选的技术方案，步骤1)所述的待测样品包括全血、血浆、血清或胸腔积液。作为优选的技术方案，步骤2)中所述的PCR反应体系中，各组分的含量如下：其中，引物组合物中各引物的浓度均为300nM。本专利技术磺酰脲类药物相关基因的基因多态性检测试剂盒采用SYBR染料法，建立了针对人类相关基因(CYP2C9、KCNJ11和ABCC8)的基因多态性(如表1所示)的多重实时PCR检测方法。本专利技术经过大量试验，研究和分析成功筛选出能够用于快速、灵敏、有效地检测CYP2C9、KCNJ11和ABCC8基因多态性的引物组合物，并利用这些引物开发出用于检测磺酰脲类药物相关基因多态性的方法和试剂盒。表1磺酰脲类药物相关基因的基因多态性形式磺酰脲类药物相关基因的特异性引物见下表2-5，表6为内参的检测引本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物，其特征在于，该引物组合物包括CYP2C9引物组、KCNJ11引物组及ABCC8引物组；所述的CYP2C9引物组包括以下引物：P1‑FW：5’‑AGAGGAGCATTGAGGAAC‑3’；P1‑FS：5’‑AAGAGGAGCATTGAGGACT‑3’；P1‑R：5’‑TAACAACCAGGACTCAT‑3’；P2‑FW：5’‑GCACGAGGTCCAGAGATAGA‑3’；P2‑FS：5’‑GCACGAGGTCCAGAGATAGC‑3’；P2‑R：5’‑CGGTGATGGTAGAGGTTTAA‑3’；所述的KCNJ11引物组包括以下引物：P3‑F：5’‑GCACGGTACCTGGGCAC‑3’；P3‑RW：5’‑GCACGGTACCTGGGCAT‑3’；P3‑RS：5’‑CACCGAGAGGACTCTGCA‑3’；所述的ABCC8引物组包括以下引物：P4‑FW：5’‑CGTCAATGCCCTCATGT‑3’；P4‑FS：5’‑CGTCAATGCCCTCATGT‑3’；P4‑R：5’‑ACTGCGATGTCTGAATA‑3’。
【技术特征摘要】
1.用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物，其特征在于，该引物组合物包括CYP2C9引物组、KCNJ11引物组及ABCC8引物组；所述的CYP2C9引物组包括以下引物：P1-FW：5’-AGAGGAGCATTGAGGAAC-3’；P1-FS：5’-AAGAGGAGCATTGAGGACT-3’；P1-R：5’-TAACAACCAGGACTCAT-3’；P2-FW：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’；P2-FS：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’；P2-R：5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’；所述的KCNJ11引物组包括以下引物：P3-F：5’-GCACGGTACCTGGGCAC-3’；P3-RW：5’-GCACGGTACCTGGGCAT-3’；P3-RS：5’-CACCGAGAGGACTCTGCA-3’；所述的ABCC8引物组包括以下引物：P4-FW：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；...
【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：宁波美丽人生医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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