检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的引物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变检测的引物、试剂盒和方法，所述引物包括扩增高铁血红蛋白血症CYB5R基因的正、反向引物和测序引物。本发明专利技术基于Sanger测序法，利用所述引物可用于快速检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因的突变情况。

【技术实现步骤摘要】
检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的引物、试剂盒和方法
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的引物和方法。
技术介绍
高铁血红蛋白血症是指血中高铁血红蛋白(methemoglobin)水平超过血红蛋白总量1％时的临床状态。按原因分为获得性和遗传性两大类。获得性高铁血红蛋白血症最常见，多为摄入某些氧化(还原)性药物或毒物时的一过性表现。遗传性高铁血红蛋白血症(hereditarymethemoglobinemia，HM)绝大部分为NADH-细胞色素b5还原酶(NADH-cytochromeb5reductase，b5R)的遗传缺陷所致，呈常染色体隐性遗传，故又称隐性先天性高铁血红蛋白血症(recessivecongenitalmethemoglobinemia，RCM)；一小部分由血红蛋白先天异常(即血红蛋白M)引起，一般呈显性遗传。遗传性高铁血红蛋白血症是一种常染色体隐性遗传病，绝大多数是由患者的NADH-细胞色素b5还原酶遗传缺陷所致。编码b5R的基因全长约31kb，有9个外显子和8个内含子，定位于2号染色体2q13-qter(Genbank：NM-00022)，其mRNA长1921bp(Genbank：NM-000398)。国内外在遗传性高铁血红蛋白血症患者中已发现多种不同的b5R基因突变。b5R在体内有两种存在形式：胞浆可溶型和膜结合型。前者主要存在于红细胞，是红细胞高铁血红蛋白还原系统的主要成员，其活性占红细胞高铁血红蛋白总还原能力的2/3以上。膜结合型b5R广泛分布于组织细胞，参与多种生物化学活动，如脂肪酸代谢、胆固醇合成、药物生物转化。两种形式的b5R由同一个染色体单基因编码，胞浆可溶型含275个氨基酸残基；膜结合型除含胞浆可溶型的275个氨基酸残基外，氨基端还有一个由25个氨基酸残基组成的膜结合区。编码b5R的基因位于22号染色体，全长31kb，含9个外显子和8个内含子。b5R缺陷导致的RCM可分成三型：Ⅰ型又称红细胞型，以发绀为主要临床表现，b5R活性降低仅限于红细胞，患者能应付较轻的体力劳动，寿命一般不受影响；Ⅱ型又称全身型，包括红细胞在内的全身细胞都存在b5R活性下降，临床上除发绀外，还伴有神经精神症状，患者一般在成年前夭亡；Ⅲ型为血细胞型，最少见，酶活力下降局限于血细胞。近年文献报道，Ⅲ型实际上与Ⅰ型是同一类型。寻找和分析b5R的基因突变类型，有助于阐明该单一基因突变可导致临床上不同遗传性高铁血红蛋白血症表型的分子机制。本专利技术采用Sanger测序法检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因基因，并且设计的引物分别扩增包含高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变位点的DNA片段，通过测序结果的分析，可以很直观的了解高铁血红蛋白血症CYB5R基因的突变情况，扩增引物设计时加上了M13接头，并使用M13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因位点突变的情况。检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因的扩增引物和测序引物；其中扩增引物的碱基序列为：CYB5R-E1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCAGTCTCCATCCC；CYB5R-E1-R：AACAGCTATGACCATGGCGTAAGTAGCGGTCAC；CYB5R-E2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGGTAGTGTGGACAAG；CYB5R-E2-R：AACAGCTATGACCATGCAATGCTGTGATGCTGAC；CYB5R-E3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAAAGGAGGAATGGG；CYB5R-E3-R：AACAGCTATGACCATGCCTGGTGGAAATGTAAAGC；CYB5R-E4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGAGTCTGTTGGAATGA；CYB5R-E4-R：AACAGCTATGACCATGGGAGCACTGGGTCTTTG；CYB5R-E5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGAAGAGGCACTTGTC；CYB5R-E5-R：AACAGCTATGACCATGTCACCCATCCACACAGAG；CYB5R-E6-7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCATGGCATGTTTGATGGC；CYB5R-E6-7-R：AACAGCTATGACCATGCAGGGTAAGCTGAGTTTCC；CYB5R-E8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGTCTCTGTTGAGTGTCT；CYB5R-E8-R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAAGGTGAACTGTG；CYB5R-E9-F1：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTCCATTCTTCAGCAT；CYB5R-E9-R1：AACAGCTATGACCATGGAGGGCTTTCTGGTGTCA；CYB5R-E9-F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATGAGACATTGACACCAGAA；CYB5R-E9-R2：AACAGCTATGACCATGCAGGAGAATGGCGTGAAC；CYB5R-E9-F3：TGTAAAACGACGGCCAGTACTACAACCTCCACCTCTC；CYB5R-E9-R3：AACAGCTATGACCATGCTTCCAGCCACCTATCTTC；测序引物的碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术的第二个目的在于提供一种检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的试剂盒：其特征在于，所述试剂盒包括：(1)样品DNA抽提试剂；(2)检测体系PCR反应试剂，包括扩增引物，其碱基序列为：CYB5R-E1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCAGTCTCCATCCC；CYB5R-E1-R：AACAGCTATGACCATGGCGTAAGTAGCGGTCAC；CYB5R-E2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGGTAGTGTGGACAAG；CYB5R-E2-R：AACAGCTATGACCATGCAATGCTGTGATGCTGAC；CYB5R-E3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAAAGGAGGAATGGG；CYB5R-E3-R：AACAGCTATGACCATGCCTGGTGGAAATGTAAAGC；CYB5R-E4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGAGTCTGTTGGAATGA；CYB5R-E4-R：AACAGCTATGACCATGGGAGCACTGGGTCTTTG；CYB5R-E5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGAAGAGGCACTTGTC；CYB5R-E5-R：AACAGCTATGACCATGTCACCCATCCACACAGAG；CYB5R-E6-7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCATGGCATGTTTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因的扩增引物和测序引物；其中扩增引物的碱基序列为：CYB5R‑E1‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCAGTCTCCATCCC；CYB5R‑E1‑R：AACAGCTATGACCATGGCGTAAGTAGCGGTCAC；CYB5R‑E2‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGGTAGTGTGGACAAG；CYB5R‑E2‑R：AACAGCTATGACCATGCAATGCTGTGATGCTGAC；CYB5R‑E3‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAAAGGAGGAATGGG；CYB5R‑E3‑R：AACAGCTATGACCATGCCTGGTGGAAATGTAAAGC；CYB5R‑E4‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGAGTCTGTTGGAATGA；CYB5R‑E4‑R：AACAGCTATGACCATGGGAGCACTGGGTCTTTG；CYB5R‑E5‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGAAGAGGCACTTGTC；CYB5R‑E5‑R：AACAGCTATGACCATGTCACCCATCCACACAGAG；CYB5R‑E6‑7‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCATGGCATGTTTGATGGC；CYB5R‑E6‑7‑R：AACAGCTATGACCATGCAGGGTAAGCTGAGTTTCC；CYB5R‑E8‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGTCTCTGTTGAGTGTCT；CYB5R‑E8‑R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAAGGTGAACTGTG；CYB5R‑E9‑F1：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTCCATTCTTCAGCAT；CYB5R‑E9‑R1：AACAGCTATGACCATGGAGGGCTTTCTGGTGTCA；CYB5R‑E9‑F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATGAGACATTGACACCAGAA；CYB5R‑E9‑R2：AACAGCTATGACCATGCAGGAGAATGGCGTGAAC；CYB5R‑E9‑F3：TGTAAAACGACGGCCAGTACTACAACCTCCACCTCTC；CYB5R‑E9‑R3：AACAGCTATGACCATGCTTCCAGCCACCTATCTTC；测序引物的碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。...

【技术特征摘要】
1.检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因的扩增引物和测序引物；其中扩增引物的碱基序列为：CYB5R-E1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCAGTCTCCATCCC；CYB5R-E1-R：AACAGCTATGACCATGGCGTAAGTAGCGGTCAC；CYB5R-E2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGGTAGTGTGGACAAG；CYB5R-E2-R：AACAGCTATGACCATGCAATGCTGTGATGCTGAC；CYB5R-E3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAAAGGAGGAATGGG；CYB5R-E3-R：AACAGCTATGACCATGCCTGGTGGAAATGTAAAGC；CYB5R-E4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGAGTCTGTTGGAATGA；CYB5R-E4-R：AACAGCTATGACCATGGGAGCACTGGGTCTTTG；CYB5R-E5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGAAGAGGCACTTGTC；CYB5R-E5-R：AACAGCTATGACCATGTCACCCATCCACACAGAG；CYB5R-E6-7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCATGGCATGTTTGATGGC；CYB5R-E6-7-R：AACAGCTATGACCATGCAGGGTAAGCTGAGTTTCC；CYB5R-E8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGTCTCTGTTGAGTGTCT；CYB5R-E8-R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAAGGTGAACTGTG；CYB5R-E9-F1：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTCCATTCTTCAGCAT；CYB5R-E9-R1：AACAGCTATGACCATGGAGGGCTTTCTGGTGTCA；CYB5R-E9-F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATGAGACATTGACACCAGAA；CYB5R-E9-R2：AACAGCTATGACCATGCAGGAGAATGGCGTGAAC；CYB5R-E9-F3：TGTAAAACGACGGCCAGTACTACAACCTCCACCTCTC；CYB5R-E9-R3：AACAGCTATGACCATGCTTCCAGCCACCTATCTTC；测序引物的碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。2.检测高铁血红蛋白血症CYB5R基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)样品DNA抽提试剂；(2)检测体系PCR反应试剂，包括扩增引物，其碱基序列为：CYB5R-E1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCAGTCTCCATCCC；CYB5R-E1-R：AACAGCTATGACCATGGCGTAAGTAGCGGTCAC；CYB5R-E2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGGTAGTGTGGACAAG；CYB5R-E2-R：AACAGCTATGACCATGCAATGCTGTGATGCTGAC；CYB5R-E3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAAAGGAGGAATGGG；CYB5R-E3-R：AACAGCTATGACCATGCCTGGTGGAAATGTAAAGC；CYB5R-E4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGAGTCTGTTGGAATGA；CYB5R-E4-R：AACAGCTATGACCATGGGAGCACTGGGTCTTTG；CYB5R-E5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGAAGAGGCACTTGTC；CYB5R-E5-R：AACAGCTATGACCATGTCACCCATCCACACAGAG；CYB5R-E6-7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCATGGCATGTTTGATGGC；CYB5R-E6-7-R：AACAGCTATGACCATGCAGGGTAAGCTGAGTTTCC；CYB5R-E8-F：TGTAAAACGACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，吴鹏飞，孙翠莲，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33