诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物的方法技术

本发明专利技术涉及诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物载脂蛋白E的方法。本发明专利技术提供了检测APOE基因多态性的检测试剂和检测方法，解决了现有技术的测序结果中存在较高比例的等位基因非特异性交叉扩增的技术问题。

Methods for diagnosing lipid metabolism related diseases or markers of Alzheimer's disease

The invention relates to a method for diagnosing lipid metabolism related diseases or apolipoprotein E of Alzheimer's disease markers. The invention provides a testing agent and a testing method for detecting APOE gene polymorphism, and solves the technical problem that there is a high proportion of allele non-specific cross-amplification in the sequencing result of the prior art.

【技术实现步骤摘要】
诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物的方法
本专利技术属于诊断领域，更具体地，本专利技术涉及诊断冠心病或心肌梗塞相关标志物的方法；尤其涉及一种载脂蛋白E(APOE)基因两个SNP位点rs429358和rs7412的多态性检测试剂盒。
技术介绍
载脂蛋白E基因编码载脂蛋白E前体(ApolipoproteinE，ApoE)，含有317个氨基酸残基，经过加工后的载脂蛋白E包含299个氨基酸残基，分子量为34.2KD，是一种具有脂蛋白转运、代谢、修复细胞膜、神经发育、修复损伤等多种功能的脂质转运蛋白。ApoE与多种心脑血管疾病密切相关，参与高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的整个发生发展过程，ApoE基因多态性是这些疾病早期及发展过程中个体差异的主要原因。其遗传多态性主要受控于两个SNP位点rs429358和rs7412，这两个SNP位点通过不同的核酸组合决定了ApoE的三种等位基因型：ε2(rs429358为T，rs7412为T)、ε3(rs429358为T，rs7412为C)、ε4(rs429358为C，rs7412为C)，这三种类型等位基因分别编码三种ApoE蛋白亚型，即ApoE2(其蛋白序列的112位和158位均为半胱氨酸)、ApoE3(其蛋白序列的112位为半胱氨酸，158位为精氨酸)、ApoE4(其蛋白序列的112位和158位均为精氨酸)。因此，ApoE基因有ε2/ε2、ε3/ε3、和ε4/ε4三种纯合子型与ε2/ε3、ε2/ε4和ε3/ε4三种杂合子型。自然人群中，基因频率ε3分布最高，ApoE3/3(即ε3/ε3)表型分布约70％。ApoE基因具有异构体特异性，即不同基因编码的蛋白质功能具有差异性，从而导致不同蛋白质对脂质的代谢能力不同、抗氧化及抗炎症能力不同。ApoE基因多态性是冠心病(CHD)早期及发展过程中个体差异的主要原因，通过ApoE基因多态性的检测可以了解个体CHD及心肌梗塞(MI)的易感性。ApoE2的作用是降低胆固醇浓度，对冠状动脉硬化的发展有一定的防护作用，而ApoE4则会使血浆LDL-C、TC浓度升高，易诱发CHD及MI。ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，ApoE4携带者阿尔茨海默病的易感性增加。ApoE突变后，其与LDL-R的亲和力发生改变。携带一个E4等位基因的个体其发展为AD的可能性高于无E4等位基因的个体约3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大约为15％，而在AD患者中的比例可达40％。ApoE4是AD的重要危险因素。通过检测ApoE的基因型，可了解是否为AD易感人群，继而从病因学延缓AD的发生、发展；并定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法、基因芯片杂交法、PCRRFLP方法、PCR扩增产物毛细管电泳分析法、PCR-SSCP、PCR高分辨熔解曲线分析技术、PCRTaqmanMGB(MinorGrooveBinder)探针法、AS-PCR法、Cast-PCR法等。这些方法或多或少存在着仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点，需要加以改进和优化。本领域中，多数的遗传标记物以检测组织样本或血液样本为主，较少地采用口腔上皮细胞样本。获取口腔上皮细胞作为样本来进行检查，虽然取样简单、对患者无痛苦，但是相比于血清检测，其一次取样获得的DNA样本量少、样本背景复杂，对于检测的精密度，检测试剂的敏感性的要求显著更高，因此本领域中对于疾病检测以获取口腔上皮细胞(例如以唾液拭子来获取)作为检测样本的情形少之又少，成功开发出成熟的诊断试剂的也很少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种载脂蛋白E(APOE)基因的多态性检测试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供检测载脂蛋白E基因多态性的试剂，所述的试剂包括：(a)前引物，其包括分别具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:6所示的核苷酸序列的6条引物；(b)后引物，其包括分别具有SEQIDNO:7～SEQIDNO:12所示的核苷酸序列的6条引物；和(c)针对(a)和(b)引物的扩增产物的1条探针，所述的探针具有SEQIDNO:17所示的核苷酸序列。在一个优选例中，所述的试剂还包括提高检测特异性的序列片段，其是具有SEQIDNO:13～SEQIDNO:16所示的核苷酸序列的4条序列片段。在另一优选例中，所述的探针为Taqman探针。在另一优选例中，所述试剂还包括：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，TaqManMasterMix(含内参ROX染料)混合液，和/或空白对照。在另一优选例中，所述试剂置于试剂盒中，且该试剂盒中还包括唾液拭子和/或阐明操作方法的使用说明书。在另一优选例中，所述的基因多态性是载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性。在本专利技术的另一方面，提供前面任一所述的试剂的用途，用于制备检测检测载脂蛋白E基因多态性的试剂盒。在本专利技术的另一方面，提供一种检测载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性的方法，所述方法包括：(i)以待测样品为模板，以前面任一所述的试剂进行PCR扩增；(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性。在一个优选例中，所述的待测样品为取自于口腔的体液样品；较佳地，其为含有口腔上皮细胞的样品。在本专利技术的另一方面，提供如下判别多态性：rs429358为T，rs7412为T，载脂蛋白E基因型为ε2型；rs429358为T，rs7412为C，载脂蛋白E基因型为ε3型；rs429358为C，rs7412为C，载脂蛋白E基因型为ε4型。在本专利技术的另一方面，提供所述的检测载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性的方法不是以获得疾病诊断结果为直接目的的方法；较佳地，其不是诊断方法。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1为E2/E2型ApoE基因的扩增曲线图；图2为E2/E3型ApoE基因的扩增曲线图；图3为E2/E4型ApoE基因的扩增曲线图；图4为E3/E3型ApoE基因的扩增曲线图；图5为E3/E4型ApoE基因的扩增曲线图；图6为E4/E4型ApoE基因的扩增曲线图；图7为阴性对照的PCR扩增曲线图；图8为E2/E2型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；图9为E2/E3型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；图10为E2/E4型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；图11为E3/E3型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；图12为E3/E4型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；图13为E4/E4型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；图14为阴性对照的PCR扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；图15为本专利技术的检测试剂的工作示意图。具体实施方式本专利技术人致力于提高载脂蛋白E(APOE)基因多态性检测的检测效率，特别是针对口腔样本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测载脂蛋白E基因多态性的试剂，其特征在于，所述的试剂包括：(a)前引物，其包括分别具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的6条引物；(b)后引物，其包括分别具有SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的6条引物；和(c)针对(a)和(b)引物的扩增产物的1条探针，所述的探针具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.检测载脂蛋白E基因多态性的试剂，其特征在于，所述的试剂包括：(a)前引物，其包括分别具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:6所示的核苷酸序列的6条引物；(b)后引物，其包括分别具有SEQIDNO:7～SEQIDNO:12所示的核苷酸序列的6条引物；和(c)针对(a)和(b)引物的扩增产物的1条探针，所述的探针具有SEQIDNO:17所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的试剂还包括提高检测特异性的序列片段，其是具有SEQIDNO:13～SEQIDNO:16所示的核苷酸序列的4条序列片段。3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的探针为Taqman探针。4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，TaqManMasterMix混合液，和/或空白对照。5.如权利要求1～4任一所述的试剂，其特征在于，所述试剂置于试剂盒中，且该试剂盒中还包括唾液拭子和/或阐明操作方法的使用说明书...

【专利技术属性】
技术研发人员：江海松，富磊，杨青，凌霄汉，刘颍，江城松，胡建容，
申请(专利权)人：上海惠皓医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31