本发明专利技术公开了慢性阻塞性肺疾病诊断相关基因。本发明专利技术通过高通量筛选在慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中存在差异表达的基因，后经大样本QPCR验证证明DEFA1B基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中的含量比正常人高。据此可将DEFA1B基因作为诊断慢性阻塞性肺疾病的生物标志物。本发明专利技术的研究成果为临床上进行慢性阻塞性肺疾病的早期诊断提供了一种无创的方法，适于临床推广。
Use of DEFA1B gene in the preparation of diagnostic tools for chronic obstructive pulmonary disease
The invention discloses a diagnosis related gene of chronic obstructive pulmonary disease. The DEFA1B gene is differentially expressed in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and normal people by high throughput screening, and the content of DEFA1B gene in the blood of COPD patients is higher than that of normal people by large sample QPCR verification. Accordingly, the DEFA1B gene can be used as a biomarker for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease. The research result of the invention provides a noninvasive method for early diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease in clinic and is suitable for clinical popularization.
【技术实现步骤摘要】
DEFA1B基因在制备慢性阻塞性肺疾病的诊断工具中的用途
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒以及DEFA1B基因在制备慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒中的用途。
技术介绍
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种常见的气流受限性呼吸系统疾病，其气流受限通常呈进行性发展，伴有吸入有害气体或颗粒后形成的慢性气道炎症反应。临床主要表现为呼吸困难和慢性咳嗽、咳疲。世界范围内，各国慢阻肺的患病率变异性较大。一项针对拉丁美洲墨西哥城、蒙得维的亚等五大城市40岁以上人群的调查数据显示，慢阻肺的患病率从7.8％到19.7％不等；同时中国的慢阻肺形势也不容乐观，2007年的一份调查数据显示，在北京、天津、上海、广州等7个地区40岁及以上人群中慢阻肺患病率己达8.2％，其中男性的患病率甚至己经达到12.4％。尽管调查数据有竖差异，但是仍可以看出慢阻肺总体患病率形势的严峻。随着人口的老龄化、缺血性心脏病与感染性疾病死亡率的下降以及吸烟人口的增多，慢阻肺的死亡率也逐年增高。世界卫生组织调查数据显示，2012年全球共有310万人死于慢阻肺，占全球总死亡人数的5.6％，慢阻肺成为2012年全球第3大死因，据全球疾病负担项目估计，到2020年慢阻肺将继续占据全球死亡原因第3位。与患病率、死亡率相应的还有慢阻肺带来的巨大经济和社会负担。欧盟2003年的数据显示，居民呼吸道疾病花费占整个医疗支出的6％，而其中慢阻肺相关费用占据了整个呼吸道疾病花费的56％。同样在2003年，美国国家心肺血液研究所估计美国公民全年慢阻肺相关的花费总额达321亿美元，其中与慢阻肺间接相关的花费达180亿美元。因此，做好慢阻肺的预防、诊断和治疗不仅有着医疗方面的意义，而且兼具着巨大的经济和社会意义。
技术实现思路
本专利技术利用高通量测序技术发现DEFA1B基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中的表达较正常人存在差异，与正常人相比，DEFA1B基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中表达上调，通过检测DEFA1B基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有慢性阻塞性肺疾病、或判断该受试者患有慢性阻塞性肺疾病的风险高低、或判断慢性阻塞性肺疾病患者预后复发与否。本专利技术的目的在于提供DEFA1B基因在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增DEFA1B基因和管家基因的引物对。所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述PCR缓冲液包含：25mMKCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实施方案中，扩增DEFA1B基因的正向序列5’-AAAGCATCCAGGCTCAAG-3’(SEQIDNO.1)，反向序列5’-TTCCATAGCGACGTTCTC-3’(SEQIDNO.2)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’(SEQIDNO.3)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.4)。优选地，本专利技术的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。优选逆转录反应液包含：250mMTris-HCL(pH8.3)、375mMKCL、15mMMgCL2、50mMDTT。RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。优选地，本专利技术的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。本专利技术的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本专利技术的另一目的在于提供一种诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒。所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增DEFA1B基因和管家基因GAPDH的引物对。所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述PCR缓冲液包含：25mMKCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增DEFA1B基因的正向序列5’-AAAGCATCCAGGCTCAAG-3’，反向序列5’-TTCCATAGCGACGTTCTC-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。优选地，本专利技术的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。优选逆转录反应液包含：250mMTris-HCL(pH8.3)、375mMKCL、15mMMgCL2、50mMDTT。RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。优选地，本专利技术的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。本专利技术的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本专利技术还提供了利用上述诊断试剂盒诊断慢性阻塞性肺疾病的方法，所述方法包括：(1)提取来自受试者血液样本RNA；(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；(3)在荧光实时定量PCR仪上将DEFA1B基因和管家基因进行扩增检测；(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；(5)与正常人相比，DEFA1B基因表达上调，诊断该研究对象患有慢性阻塞性肺疾病或者患有慢性阻塞性肺疾病的风险高，或诊断慢性阻塞性肺疾病患者预后复发。步骤(1)的具体实施方法为：使用RNA抽提试剂进行血液总RNA的提取，详细步骤参照产品说明书进行。步骤(2)的具体实施方法为：用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/LdNTP，0.1mmol/lDTT，30μmmol/lOligo(dT)，200U/μlM-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃10s，60℃60s)*42个循环。以SYBRGreen作为荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.DEFA1B基因在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增DEFA1B基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
【技术特征摘要】
1.DEFA1B基因在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增DEFA1B基因和管家基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述扩增DEFA1B基因的引物对的序列如下：正向序列5’-AAAGCATCCAGGCTCAAG-3’，反向序列5’-TTCCATAGCGACGTTCTC-3’；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的引物对的序列如下：正向序列5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，反向序列5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：25mMKCL、2.5mMMgCL2、200mM(NH4)2SO4。4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系和/或RNA提取试剂；所述逆转录体系包含：T重复寡核苷酸OligodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆转录反应液包含：250mMpH8.3Tris-HCL、375mMKCL、15mMMgCL2、50mMDTT。...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘敏，任雁宏，
申请(专利权)人：中日友好医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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