一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法技术

本发明专利技术提供了一种基于高通量测序技术检测α‑地中海贫血基因突变的引物组合及其方法，其中，所用的引物组合包括特异性扩增HBA基因和特异性扩增HBA基因上下游2Mb范围内紧密连锁多态性位点(SNP)的引物。本发明专利技术的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，可以对所有α‑地贫突变进行胚胎移植前检测，并且检测过程更加快速，检测结果也更为准确。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法
本专利技术提供了一种基于高通量测序技术检测人类胚胎中α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法，属于基因检测

技术介绍
地中海贫血(以下简称“地贫”)是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。在我国南方α-地贫的高发区，总发病率为2.46％，其中广西、广东、江西、四川和浙江各省(区)的发病率分别为14.95％、4.11％、2.60％、1.92％和1.20％。地贫分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。目前，α-地贫还没有效的根治方法，主要以预防为主。因此开展检测，提早发现贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。随着下一代测序技术的广泛应用，单基因遗传性疾病相关检测也发展较快。针对多种疾病相关的Panel检测也不断应用，在欧美发达国家结合核酸质谱技术、基因芯片技术等开展近3000多个单基因遗传疾病的检测项目，我国的单基因疾病检测也在不断发展中，已由传统只检测几个基因突变位点的一代测序技术、Real-timePCR技术逐步地向多基因多位点检测方面扩展。传统PCR虽然灵敏，但应用于PGD的时候，存在污染、等位基因脱扣、扩增失败等缺点。单细胞PCR的扩增失败率大约是5％～10％。扩增失败可能与样本的准备过程有关，如未移入细胞、靶DNA的丢失和变性以及细胞的裂解过程。污染是导致误诊的重要原因，通过设立严格的阴性和阳性对照、严格的实验室操作以及单精子卵胞浆内注射技术的应用可以减少污染。等位基因脱扣(alleledropout，ADO)是指在单细胞扩增时，杂合子的两个等位基因之一出现扩增，而另一个等位基因无扩增产物。ADO是导致误诊的主要原因之一，通常有5％～20％的单细胞扩增出现等位基因脱扣。其发生机理复杂，可能与染色体嵌合体、部分二倍体细胞中存在单倍体细胞和PCR变性的温度有关，α-地贫HBA基因上有区域位于16号染色体短臂端粒，同源性较高，多态性很低，高GC等原因，导致PCR扩增失败，可选择的有效的SNP位点也很少，最终导致构建单体型失败。为了克服现有技术的上述局限性，该试剂盒设计了一种基于高通量测序技术检测α-地贫的方法。提供了一种用于检测α-地中海贫血基因突变的引物组合物，其由特异扩增中国人群α-地贫SEA、4.2kb、3.7kb三种最常见缺失型突变和CS、WS、QS三种最常见点突变的引物，以及特异扩增人类染色体chr16：1-334700区域(包括啦α-珠蛋白基因HBA1、HBA2基因)以及HBA基因下游2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组成(总共1354对引物)。这些引物的特点为：1)在目标染色体上序列唯一；2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度；3)多对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行多重反应；4)通过高通量测序分析既能对地贫进行基因检测，又能通过SNP连锁分析判断胚胎的致病性，也能通过目标区域覆盖深度判断拷贝数异常。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人类胚胎α-地中海贫血突变检测的引物组合及方法，该技术基于家系SNP连锁分析原理，可以对所有α-地贫突变进行胚胎移植前诊断。为了实现本专利技术，我们采用了以下技术方案：1、采用了单细胞全基因组扩增技术，可以将微量细胞的基因组放大，使其达到能够检测的量。该技术首先通过特殊的随机引物跟基因组随机结合、延伸，这些引物末端带有一段特殊的通用序列，可以使扩增子的结尾互补成环，从而很大程度上防止DNA的指数性扩增，增加了全基因组扩增的均一性；最后，用一对引物进行指数扩增，增加扩增产量。随后将扩增的基因组随机打断，在打断的DNA片段两端加上通用的测序接头，构建好可以用于测序的测序文库。利用乳液PCR技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，通过对阳性模板进行富集以达到测序要求，然后通过基于半导体测序技术进行测序。2、靶向捕获方法：是一种大规模的多重PCR扩增技术，能够实现几千甚至上万重引物对进行快速扩增目标区域检测低频率或稀有突变，是一种准确、经济、高效的基因组目标区域深度平行测序技术。本专利技术设计了一种基于高通量测序技术检测α-地贫的方法。尤其提供了一种用于检测α-地中海贫血基因突变的引物组合物，其由特异扩增中国人群α-地贫SEA、4.2kb、3.7kb三种最常见缺失型突变和CS、WS、QS三种最常见点突变的引物，以及特异扩增人类染色体chr16：1-334700区域(包括了α-珠蛋白基因HBA1、HBA2基因)以及HBA基因下游2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组成(总共1354对引物)。这些引物的特点为：1)在目标染色体上序列唯一；2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度；3)多对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行多重反应；(4)通过高通量测序分析既能对地贫进行基因检测，又能通过SNP连锁分析判断胚胎的致病性，也能通过目标区域覆盖深度判断拷贝数异常；在涉及的每个致病外显子或突变位点，设计一对或多对引物探针来覆盖，而两端的DNA序列则设计目的基因5’端前和3’端后几个bp至十几个bp，保证靶向捕获技术的高覆盖度；采用涉及多重PCR引物对目的基因进行扩增，将微量DNA信息放大到可以检测到的信号，实现高灵敏度的目的；在涉及到的百种基因DNA序列的保守且避免二级结构的区域设计高密度的多重PCR引物，引物长度约15-30bp，扩增长度120-220bp左右并使扩增的DNA序列GC含量尽量均一，同时对设计的引物进行5’端生物素、荧光素、地高辛等修饰，但3’端不做任何修饰以便使顺利延伸，避免各引物间相互干扰，达到高分辨率的目的。3、高通量测序方法：主要包括采用设计好的引物Panel，条形码和微量的DNA构建文库，对构建好的文库进行质检，将质检通过的文库转移到模板制备及富集系统进行模板扩增，扩增富集的文库模板的阳性模板被放置到IonTorrent进行测序实验。主要包括对文库构建流程、文库定量流程及上机测序流程进行研发和优化；对靶向捕获的DNA序列进行接头序列的连接及文库DNA纯化，尽量避免引物二聚体或者大片段的干扰；对文库DNA进行尽量精确定量，使得尽量多的样本量能够混合一次测序；对上机测序过程进行优化，获得更多质量高的数据量可以用于分析；对高通量测序数据的生物信息学技术进行优化，精确基因突变算法，得到高准确度的结果信息。3、生物信息分析方法：(1)地贫基因检测分析方法：高通量测序下机数据利用Torrent_Server_5.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列、用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组、分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。利用父母和先证者与α-地贫致病基因HBA1紧密连锁多态性位点(SNP)在染色体上的位置和基因型构建单体型。利用已经建好的单体型对胚胎是否致病进行判断。(2)Ampliseq目标区域拷贝数分析方法：利用确定正常的样本构建数据库，计算每个样本SEA缺失区域染色体的相对序列值(RC)，通过不同样本的平均值，统计分析、确定参考值的范围。根据参考值对样本的缺失型进行判断。(3)缺失区域S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人类胚胎α‑地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于：所述引物组合由SEQ ID NO：1～1354所示序列的多重PCR引物组成。

【技术特征摘要】
1.一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于：所述引物组合由SEQIDNO：1～1354所示序列的多重PCR引物组成。2.一种基于高通量测序平台检测α-地中海贫血基因突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)胚胎细胞全基因组扩增和夫妻双方全血DNA提取：将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，和全血DNA提取，得到DNA后进行浓度测定；(2)目的片段扩增：将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；(8)高通量测序：采用IonProton或IonPGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序；(9)生物信息学分析：对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序进行生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述的多重PCR反应条件如下：99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15sec，60℃退火和延伸4min，22个循环；10℃终止。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述的P1接头如下：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’和5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’；所述特异性接头是由如下正反两个序列组成的Barcodex：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’和5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’，Barcodex代表的具体序列如下：Barcode1：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；Barcode2：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；Barcode3：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’；Bar...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓红辉，卢绍月，方雅亮，
申请(专利权)人：广州达瑞生殖技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44