本发明专利技术涉及基因检测领域，具体涉及用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法。所述引物组合包括核苷酸序列如Seq ID No.1‑40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异。其中每一对引物用于扩增MITF基因中的一个区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同，来源于不同区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列彼此不同。本发明专利技术的检测方法，采用所述20对引物特异性扩增样品中MITF基因的不同区域，利用UMI对扩增产物的二代测序数据进行降噪，从而准确检测出低拷贝数变异。
【技术实现步骤摘要】
用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法。
技术介绍
基因突变的检测对于许多种肿瘤检测，胎儿遗传状态检测都具有重要的价值。目前针对胎儿的基因突变筛查，主要基于SNParray等多个平台系统，对胎儿及父母进行全基因组SNP分析，成本昂贵；而常规依赖聚合酶的边合成边测序难以保证碱基准确性，发生的碱基错误造成测序噪声，因此常规文库捕获和高通量测序不能解决由扩增和测序造成的变异检测偏差；而较新的循环单分子扩增和重测序技术(cSMART)受其环化文库效率和背靠背引物位点的设计的影响。孕妇外周血中胎儿来源的游离DNA的发现，为无创性检测胎儿遗传状态提供了可能。孕妇外周血cfDNA源于母亲和胎儿，胎儿游离DNA(cffDNA)来源于胎盘滋养层细胞，约占总cfDNA的10-20％，片段长度为140-180bp左右。将cffDNA从母亲来源的DNA中鉴别出来仍然是目前的技术难点，特别是如何检测母血血浆中cffDNA所导致的等位基因比例不平衡。目前国际上对cffDNA的研究主要通过位点特异性PCR，MALDI-TOF质谱法，数字PCR和高通量测序等方法进行。目前主流的无创产前检测方法均基于胎儿变异位点检测和单体型检测：通过对母血血浆中cfDNA进行位点检测，然后利用相对变异剂量(RMD)和相对单体型剂量(RHDO)分析孕妇血浆中胎儿变异位点和单体型的相对含量。通过仅存在父亲中的SNP推导了父源部分的胎儿基因组，母亲来源的胎儿基因组部分则使用父亲纯合但母亲杂合的SNP进行推导。Papasavva等利用该方法对母血cfDNA进行分析，成功对其cffDNA基因型和变异位点进行分析。因此利用对cffDNA中变异位点和单体型的检测，可有效地提高胎儿致病基因的诊断准确度。MITF(Microphthalmia-associtatedtranscriptionfactor)基因(NCBI：mRNA序列号为NM_00248)全长4490bp，其中ORF编码序列为1260bp，共有9个外显子。其编码蛋白是小眼畸形相关转录因子，在黑色素细胞的发育、分化和功能调节上起着重要作用，同时还参与了肥大细胞、破骨细胞和眼色素上皮细胞的发育和分化。MITF基因突变在临床上会导致综合征性耳聋，主要表现为感音神经性聋及色素异常，后者包括虹膜异色、白额发、早白发、皮肤色素减退或雀斑沉着；其他表现还有内眦异位、高宽鼻根、多毛症、一字眉或眉毛中部潮红等。利用基因检测早期发现，早期干预，从而达到防残减残，提高人口素质的目的，对减轻患者家庭和社会的负担意义重大。因此，有必要针对MITF基因开发一种更加便捷和可靠的适合无创检测低拷贝数基因突变的技术。
技术实现思路
根据上述领域存在的需求，专利技术人研发了一种无创检测MITF基因突变的方法，在常规的多重扩增基础上，向扩增引物中引入UMI(UniqueMolecularIdentifier)分子标签，利用UMI对二代测序数据进行降噪，从而准确地检测低拷贝数变异。本专利技术请求保护的技术方案如下：用于无创检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异及其临近SNP位点。优选地，所述引物组合还包括核苷酸序列如SeqIDNo.41-44所示的2对引物。一种无创检测MITF基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行IndexPCR扩增；(4)对IndexPCR扩增产物进行文库质控后，在IlluminaNextSeq测序仪上进行150bp双端测序；(5)将测序的序列信息去除连接接头，拼接为一条原始模板序列，将原始模板序列与MITF基因的参照序列比对，并通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯一的模板序列；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性，通过计算突变序列与参照序列的比例统计出体细胞MITF基因突变率；所述预扩增中，采用核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20对引物的混合物同时特异性扩增MITF基因的不同区域，从而检测MITF基因的变异及其临近SNP位点；每一对引物扩增MITF基因中的一个区域；引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同，而来源于不同区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列彼此不相同；所述IndexPCR扩增中，采用核苷酸序列如SeqIDNo.45和46所示的正反向引物。优选地，所述预扩增中，采用核苷酸序列如SeqIDNo.1-44所示的22对引物的混合物进行扩增。优选地，在进行所述IndexPCR扩增之前，对PCR预扩增所得DNA进行磁珠纯化。优选地，在进行所述IndexPCR扩增之后，对IndexPCR扩增所得DNA进行磁珠纯化。用于检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如SeqIDNo.47-86所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而检测MITF基因的变异及其临近SNP位点。优选地，所述引物组合还包括核苷酸序列如SeqIDNo.87-90所示的2对引物。临床研究中，迫切需要一种快速、高效的检测MITF基因突变和基因型的方法。专利技术人在研究片段DNA的检测时，发现了一种新的DNA片段的检测方法，即：在扩增引物中添加UMI(UniqueMolecularIdentifier)分子标签序列，然后对DNA片段进行PCR扩增并通过第二代高通量测序技术测序，利用UMI分子标签序列对二代测序数据进行降噪，从而检测出低拷贝数变异。本专利技术根据MITF基因序列设计和筛选出核苷酸序列如SeqIDNo.47-86所示的20对特异性引物，用于扩增MITF基因的不同区域，具有特异性强，灵敏度高的优点。进一步地，为满足高通量检测的需要，在所设计的特异性引物序列的5’端加上UMI分子标签序列和接头序列，得到核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20对预扩增引物。所述预扩增引物中，所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和MITF基因不同区域的特异性引物序列；所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和MITF基因不同区域的特异性引物序列；所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同，接头序列A与接头序列B彼此不相同；同一引物对中的引物带有相同的UMI分子标签序列，不同引物对的引物带有不同的UMI分子标签序列。所述UMI分子标签序列为随机设计的核苷酸序列。用于IndexPCR扩增的正反向引物的3’端序列分别为接头序列A和接头序列B的5’端序列。此外，本专利技术还提供SeqIDNo.87-90所示的2对引物。其中，SeqIDNo.87和88所示的正反向引物(MITFmutation-F/R)用于检测MITF基因c.627C>A位点的变异，临床研究发现，此位点的变异可能导致耳聋，因此，对于该位点的检测，有助于分析胎儿罹患耳聋的概率。SeqID本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于无创检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如Seq ID No.1‑40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异及其临近SNP位点。
【技术特征摘要】
1.用于无创检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异及其临近SNP位点。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：还包括核苷酸序列如SeqIDNo.41-44所示的2对引物。3.一种无创检测MITF基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行IndexPCR扩增；(4)对IndexPCR扩增产物进行文库质控后，在IlluminaNextSeq测序仪上进行150bp双端测序；(5)将测序的序列信息去除连接接头，拼接为一条原始模板序列，将原始模板序列与MITF基因的参照序列比对，并通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯一的模板序列；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性，通过计算突变序列与参照序列的比例统计出体细胞MITF基因突变率；所述预扩增中，采用核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20对引物的混合物同时特异性扩增MITF基因的不同区域，从而检测MITF...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧军，谭博，程静，卜枫啸，卢宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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