7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种通过蛋白质工程获得的辅酶偏好性改变的7β‑羟基甾醇脱氢酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组突变体酶制剂的制备方法，以及该重组突变体酶制剂在制备熊脱氧胆酸中的应用。通过酶法耦联的辅酶再生，本发明专利技术所述重组突变体酶制剂可以高效利用相对廉价的氧化型辅酶I(NAD+)而非昂贵的氧化型辅酶II(NADP+)，催化7‑羰基石胆酸的不对称还原，有效降低了生产成本，并且具有操作简单、反应条件温和、环境友好，产率高等优势，在鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸中具有很好的应用前景。

7 beta hydroxyl sterol dehydrogenase mutant and its application in the preparation of ursodeoxycholic acid

The present invention discloses a 7-beta-hydroxysterol dehydrogenase mutant with altered coenzyme preference obtained by protein engineering, its coding gene, a recombinant expression vector and a recombinant expression transformant containing the gene sequence, a preparation method of the recombinant mutant enzyme preparation, and a recombinant mutant enzyme preparation in the preparation of bear deoxygenation. The application of cholic acid. The recombinant mutant enzyme preparation can efficiently utilize relatively cheap oxidized coenzyme I (NAD +) instead of expensive oxidized coenzyme II (NADP +) to catalyze the asymmetric reduction of 7_carbonyl cholic acid, effectively reduce the production cost, and has the advantages of simple operation, mild reaction conditions and cyclic structure. It has the advantages of friendly environment and high yield, and has a good application prospect in the preparation of ursodeoxycholic acid from goose deoxycholic acid.

【技术实现步骤摘要】
7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种辅酶偏好性改变的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体、其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂的制备方法，以及重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂在制备熊脱氧胆酸中的应用。
技术介绍
熊脱氧胆酸(UrsodeoxycholicAcid，UDCA)是名贵中药材熊胆的有效成分，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，又名乌索去氧胆酸、熊去氧胆酸，是美国FDA批准认可的治疗原发性胆汁性肝硬化的药物，还用于治疗原发性硬化性胆管炎，酒精性和脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝炎等胆汁淤积性肝病，也是胆固醇性结石溶石治疗的首选药物。1902年瑞典化学家Hammarsten首先从北极熊的胆汁中发现UDCA，1927年日本冈山大学Shoda从中国黑熊胆汁中分离、结晶得到UDCA，并对其进行了命名，1954年Kanazawa通过化学法合成UDCA并开始应用于临床(JournalofBiotechnology,2014,191:11-21)。UDCA在熊的胆汁中含量最高，而在其他动物的胆汁中含量很少。目前，UDCA主要从熊胆中提取，少量由人工合成。“活熊取胆”是从人工养殖黑熊活体中提取UDCA的方法，这种方法产率低，周期长，并且因违背自然伦理而一直受到争议。从二十世纪五十年代开始，就有化学法合成UDCA的报道，随着生物技术的发展，利用生物催化技术及与化学法结合的方法合成UDCA由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，得到极大关注。采用养殖的家禽、家畜胆汁中可大量获取的胆酸(CA)或者鹅脱氧胆酸(CDCA)作为底物，采用酶法或者化学-酶法结合的方法，人工合成具有较高价值的UDCA，减少对天然熊胆汁的需求，符合当代可持续发展的理念，具有重要的经济、社会价值和生态意义。当前工业上采用传统的七步合成法生产UDCA，以牛、羊胆汁中的胆酸(CA)为原料，酸性条件下，羧基甲酯化，再用吡啶/冰醋酸进行3位和7位二乙酰化以保护羟基，12位羟基用氧化铬氧化，随后Wolff-Kishner-黄鸣龙还原，然后水解得到CDCA，进一步氧化生成7-羰基石胆酸(7-KLCA)，最后在正丙醇中用碱金属钠还原得到UDCA。这种方法步骤繁琐，合成路线长，反应剧烈，操作安全性差，总收率低(27％-32％)，环境污染严重，不符合当代可持续发展的理念。日本专利(JP02282393)报道，在丁醇溶液中，氢氧化钠和钯碳存在的碱性条件下，于100℃，80kg/cm2的压力环境中，化学法催化7-KLCA的氢化反应，反应5h，UDCA的得率为88.2％。由于此方法需要在高压下反应，操作不便，没有投入实际应用。2009年，Riva等报道了生物催化CA转化生成12-羰基熊脱氧胆酸，进而利用化学法催化还原制备UDCA的方法(AdvSynthCatal,2009,351:1303-1311)。该生物转化反应中使用了三种酶，首先应用7α-羟基甾醇脱氢酶(7α-HSDH)和12α-羟基甾醇脱氢酶(12α-HSDH)催化CA氧化生成7,12-二羰基石胆酸，再利用7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH)催化7,12-二羰基石胆酸还原生成12-羰基熊脱氧胆酸，随后通过Wolff-Kishner-黄鸣龙还原反应生成UDCA。由于该酶法氧化还原过程中催化辅酶循环再生的酶专一性差，导致转化不完全，因此终产物UDCA的纯度不高。2011年，德国斯图加特大学Liu等首次克隆了来源于CollinsellaaerofaciensDSM3979的7β-HSDH，催化7-KLCA转化为UDCA，底物浓度40g/L，24h转化率达90％，最终产物得率71％(ApplMicrobiolBiotechnol,2011,90:127–135)。随后，其他研究者分别从Clostridiumabsonum和Ruminococcusgnavus中克隆得到第二、三个7β-HSDH，并应用于UDCA的合成(ApplMicrobBiotechnol,2012,95:1221-1233；JLipRes,2013,54:3062-9)。中国专利技术专利CN10527070A公开了一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用，对来源于Ruminococcusgnavus的7β-HSDH进行了活性改造，并与醇脱氢酶耦联构建辅酶再生循环，催化7-KLCA转化制备UDCA，底物浓度达100g/L，转化率>99％。2015年，本专利技术的专利技术人从瘤胃球菌(Ruminococcustorques)中克隆得到新的7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDHRt)，通过进化改造得到活性提高5.5倍，40℃半衰期提高3倍，最适pH从弱酸性偏移至弱碱性的突变体，并通过两步酶法级联反应成功将CDCA高效转化为UDCA，底物浓度为100mM时，最终转化率高于99％(ProcessBiochem,2015,50:598-604；JAgricFoodChem,2017,65:1178-1185；CN107099516A)。综上所述，现有的酶法制备UDCA的报道中，通常使用7β-HSDH催化7-KLCA的不对称还原制备UDCA。但现有的报道中，重组7β-HSDH的表达都是使用大肠杆菌作为宿主，表达的酶是胞内酶，需要对重组菌进行细胞破碎，才能分离获得酶液，催化剂制备过程繁琐；并且目前报道的重组7β-HSDH均是NADPH依赖型的，酶促反应液中需要加入辅酶NADPH或者NADP+(通过辅酶再生系统转化为NADPH)，由于辅酶NADPH或者NADP+价格昂贵，高昂的辅酶应用成本是酶法工业化生产UDCA的限制因素。NADH的价格相对比较便宜，并且比NADPH更加稳定。辅酶NADH与NADPH的分子结构上的差异在于：在辅酶的腺苷部分，NADPH的分子结构中多了一个额外的2'-磷酸基团。1990年，Scrutton等报道通过对辅酶结合口袋附近的氨基酸残基进行突变改造，可以有效地改变脱氢酶的辅酶依赖性(Nature,1990,343:38-43)。如果通过分子工程手段改变7β-HSDH的辅酶偏好性，得到NADH依赖型的7β-羟基甾醇脱氢酶，进而通过酶法耦联，应用更廉价的NAD+，对于降低UDCA工业化生产的成本具有重大意义。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的不足，本专利技术一方面在已报道的专一性利用辅酶NADPH的7β-HSDH的基础上，通过蛋白质工程的手段对其进行改造，提高该酶针对辅酶NADH的活性，得到可以专一性利用辅酶NADH的7β-HSDH突变体；另一方面通过选择毕赤酵母作为表达宿主，对重组7β-HSDH突变体进行胞外表达，简化酶的分离工艺。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的技术方案之一，提供了系列辅酶偏好性改变的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，即辅酶偏好性改变的7β-HSDH突变体。本专利技术以序列表SEQIDNo.2所示氨基酸序列的7β-HSDH作为母本，通过氨基酸序列以及空间结构的比对，找到辅酶结合位点附近的关键氨基酸残基，采用定点突变的策略，成功地实现了7β-HSDH辅酶依赖型的改变。在此基础上，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种7β‑羟基甾醇脱氢酶突变体，其特征在于，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质的第17位苏氨酸、第18位谷氨酸、第22位赖氨酸、第39位甘氨酸、第44位赖氨酸、第64位精氨酸、第67位苯丙氨酸、第93位半胱氨酸、第114位缬氨酸或第243位天冬酰胺中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，其特征在于，其是将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质的第17位苏氨酸、第18位谷氨酸、第22位赖氨酸、第39位甘氨酸、第44位赖氨酸、第64位精氨酸、第67位苯丙氨酸、第93位半胱氨酸、第114位缬氨酸或第243位天冬酰胺中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。2.如权利要求1所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体具有如下序列中的一种：(1)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸，第22位赖氨酸替换为丙氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；(2)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第17位苏氨酸替换为丙氨酸，第39位甘氨酸替换为天冬氨酸；(3)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸；(4)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸；(5)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸；(6)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺；(7)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；(8)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；(9)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；(10)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；(11)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；(12)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；(13)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸；(14)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；(15)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第93位...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春秀，游智能，许建和，陈琦，潘江，钱小龙，
申请(专利权)人：华东理工大学，苏州百福安酶技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31