用于二羧酸生产的宿主细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。本发明专利技术还涉及生产二羧酸的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵所述宿主细胞；和生产所述二羧酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于二羧酸生产的宿主细胞专利
本专利技术涉及能够生产二羧酸的宿主细胞。本专利技术还涉及用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法以及使用本专利技术的宿主细胞生产二羧酸的方法。本专利技术还涉及宿主细胞基因组中的修饰用于增加宿主细胞中二羧酸产生的用途。
技术介绍
4-碳二羧酸苹果酸、延胡索酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转变为1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。用于工业用途的琥珀酸主要是通过马来酸或马来酸酐的催化氢化由丁烷通过石油化学生产的。这些方法被认为是对环境有害且昂贵的。琥珀酸的发酵生产被视为生产琥珀酸的一种吸引人的替代方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。已经对(重组)酵母中C4-二羧酸的发酵生产进行了若干研究。例如，EP2495304公开了适合琥珀酸生产的重组酵母，其中编码丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和琥珀酸转运体的基因被遗传修饰。尽管在宿主细胞(例如酵母)中发酵生产二羧酸已经取得了改进，但仍需要进一步改进的用于发酵生产二羧酸的宿主细胞。专利技术概述本专利技术基于以下发现：编码直接或间接导致一种或多种辅因子(例如NADH)的氧化的酶的一种或多种基因的缺失能够增加宿主细胞(该细胞能够生产二羧酸)中的二羧酸生产，例如琥珀酸生产。因此，本专利技术涉及一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。本专利技术还涉及：-用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法，所述方法包括：-提供能够生产二羧酸的宿主细胞；和-在所述宿主细胞的基因组中进行修饰以导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，从而改善宿主细胞中的二羧酸产生；-生产二羧酸的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵本专利技术的宿主细胞，和生产所述二羧酸；以及-宿主细胞基因组中的修饰的用途，所述用途导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，从而增加宿主细胞中的二羧酸产生。附图简介图1示出了pSUC223的质粒图谱。图2示出了用FRD1表达盒置换PDC6的原理示意图。图3示出了pSUC228的质粒图谱。图4示出了GUT2缺失的原理示意图。图5示出了pSUC227的质粒图谱。图6示出了pSUC225的质粒图谱。图7示出了NDE1缺失的原理示意图。图8示出了NDE2缺失的原理示意图。图9示出了GPD1缺失的原理示意图。图10示出了GPD2缺失的原理示意图。序列表说明SEQIDNO：1示出了Escherichiacoli延胡索酸酶fumB的氨基酸序列。SEQIDNO：2示出了质粒pSUC223的完整核酸序列。SEQIDNO：3示出了缺少前19个氨基酸的FRD1(由YEL047c编码)的氨基酸序列。SEQIDNO：4示出了合成的TDH3p-FRD1-TDH3t基因的核酸序列。SEQIDNO：5示出了引物1(具有PDC65'悬突(overhang)的TDH3pFW)的核酸序列。SEQIDNO：6示出了引物2(具有与pSUC228Cre-1的悬突的TDH3tREV)的核酸序列。SEQIDNO：7示出了引物3(具有悬突TDH3t的pSUC228Cre-1FW)的核酸序列。SEQIDNO：8示出了引物4(DBC-03373，pSUC228Cre-1REV)的核酸序列。SEQIDNO：9示出了质粒pSUC228的完整核酸序列。SEQIDNO：10示出了引物5(DBC-03374，pSUC225Cre-2FW)的核酸序列。SEQIDNO：11示出了引物6(具有PDC63'悬突的pSUC225Cre-2REV)的核酸序列。SEQIDNO：12示出了缺少3个氨基酸的C末端靶向信号的糖酵解酶体(glycosomal)Trypanosomabrucei延胡索酸还原酶(FRDg)的氨基酸序列。SEQIDNO：13示出了缺少前23个N-末端氨基酸的Rhizopusoryzae延胡索酸酶的氨基酸序列。SEQIDNO：14示出了在第120-122位具有EGY到DAF修饰的Actinobacillussuccinogenes磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列。SEQIDNO：15示出了缺少C-末端过氧化物酶体靶向序列(氨基酸SKL)的Saccharomycescerevisiae过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(Mdh3)的氨基酸序列。SEQIDNO：16示出了Saccharomycescerevisiae丙酮酸羧化酶的氨基酸序列。SEQIDNO：17示出了Kluyveromyceslactis异柠檬酸裂合酶的氨基酸序列。SEQIDNO：18示出了缺少3C-末端过氧化物酶体靶向序列的Saccharomycescerevisiae过氧化物酶体苹果酸合酶(Mls1)的氨基酸序列。SEQIDNO：19示出了来自Aspergillusniger的二羧酸转运体的氨基酸序列。SEQIDNO：20示出了引物7(FW，在GUT2上游)的核酸序列。SEQIDNO：21示出了引物8(REV，GUT250bpLox66上游)的核酸序列。SEQIDNO：22示出了引物9(Cre_1REV)的核酸序列。SEQIDNO：23示出了引物10(Cre_2FW)的核酸序列。SEQIDNO：24示出了引物11(FWGUT2-KO-Cre_1)的核酸序列。SEQIDNO：25示出了引物12(REVGUT2-KO-Cre_2)的核酸序列。SEQIDNO：26示出了引物13(FW，GUT250bpLox71下游)的核酸序列。SEQIDNO：27示出了引物14(REV，在GUT2下游)的核酸序列。SEQIDNO：28示出了引物15(FW，在NDE2上游)的核酸序列。SEQIDNO：29列出引物16(REV，NDE250bpLox66上游)的核酸序列。SEQIDNO：30示出了引物17(FW，NDE250bpLox71下游)的核酸序列。SEQIDNO：31示出了引物18(REV，在NDE2下游)的核酸序列。SEQIDNO：32示出了引物19(FWNDE2-KO-Cre_1)的核酸序列。SEQIDNO：33示出了引物20(REVNDE2-KO-Cre_2)的核酸序列。SEQIDNO：34示出了引物21(FW，在NDE1上游)的核酸序列。SEQIDNO：35示出了引物22(REV，NDE150bpLox66上游)的核酸序列。SEQIDNO：36示出了引物23(FW，NDE150bpLox71下游)的核酸序列。SEQIDNO：37示出了引物24(REV，在NDE1下游)的核酸序列。SEQIDNO：38示出了引物25(FWNDE1-KO-Cre_1)的核酸序列。SEQIDNO：39示出了引物26(REVNDE1-KO-Cre_2)的核酸序列。SEQIDNO：40示出了SaccharomycescerevisiaeNDE1的氨基酸序列。SEQIDNO：41示出了SaccharomycescerevisiaeNDE2的氨基酸序列。SEQIDNO：42示出了SaccharomycescerevisiaeGUT2的氨基酸序列。SEQIDNO：43示出了pSUC22本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.23 EP 15202593.81.一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述至少一种遗传修饰导致至少一个催化胞质溶胶中辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述辅因子是NADH、NADPH或FADH2。4.根据权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶；或-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶；或-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶；或-至少一种醇脱氢酶；或-至少一种醛脱氢酶；或它们的组合。5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：40所示序列或包含与SEQIDNO：40具有至少50％同一性的序列；或-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：41所示序列或包含与SEQIDNO：41具有至少50％同一性的序列；或-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：42所示序列或包含与SEQIDNO：42具有至少50％同一性的序列；或-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：57所示序列或包含与SEQIDNO：57具有至少50％同一性的序列；或-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：58所示序列或包含与SEQIDNO：58具有至少50％同一性的序列。6.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：40所示序列或包含与SEQIDNO：40具有至少50％同一性的序列；和-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：41所示序列或包含与SEQIDNO：41具有至少50％同一性的序列。7.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶；和-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：40或SEQIDNO：41所示序列或包含与SEQIDNO：40或SEQIDNO：41具有至少50％同一性的序列；和-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：42所示序列或包含与SEQIDNO：42具有至少50％同一性的序列。9.根据权利要求7至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：40所示序列或包含与SEQIDNO：40具有至少50％同一性的序列；和-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：41所示序列或包含与SEQIDNO：41具有至少50％同一性的序列；和-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO：42所示序列或包含与SEQIDNO：42具有至少50...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克·皮特·洛斯，赵正，瑞内·维尔瓦尔，雅各布斯·托马斯·普龙克，罗尔夫·珀尔德曼斯，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL