一种短链脱氢酶及其突变体与基因的制备及应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种野生型短链脱氢酶LfSDR1与其突变体酶的基因、含有上述基因的重组表达载体的构建、重组表达转化体的制备，重组酶及重组酶的制备方法。通过将野生型短链脱氢酶LfSDR1突变获得具有两种立体选择性(R或者S立体选择性)的突变体酶，并利用突变体酶用于前手性酮的催化不对称还原，例如催化1‑苯基乙酮类化合物的不对称还原。本发明专利技术中的突变体相对于野生型，立体选择性得到了提高或者逆转，催化上述底物可以获取两种构型(R或者S型)的手性醇，例如光学纯的(R)‑或者(S)‑2‑氯‑1‑苯基乙醇，在手性醇制备领域具有很好的应用价值。

Preparation and application of a short chain dehydrogenase and its mutants and genes

The invention belongs to the field of biotechnology, and relates to a wild-type short-chain dehydrogenase LfSDR1 and its mutant enzyme gene, the construction of recombinant expression vector containing the above genes, the preparation of recombinant expression transformants, and the preparation method of recombinant enzyme and recombinant enzyme. Mutant enzymes with two stereoselectivity (R or S) were obtained by mutating the wild-type short-chain dehydrogenase LfSDR1. The mutant enzymes were used to catalyze asymmetric reduction of prochiral ketones, such as asymmetric reduction of 1_phenylethyl ketones. Compared with the wild type, the stereoselectivity of the mutant is improved or reversed. The chiral alcohols with two configurations (R or S type) can be obtained by catalyzing the above substrates, such as optically pure (R) or (S) 2_chloro_1_phenylethanol, which has good application value in the field of chiral alcohol preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种短链脱氢酶及其突变体与基因的制备及应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及短链脱氢酶LfSDH1突变体及其编码基因，含有所述短链脱氢酶突变体基因的重组表达载体与转化体构建，重组酶的制备方法，以及以不同突变体为催化剂催化不对称还原苯乙酮类化合物获取具有不同构型(S和R构型)的相应的光学纯手性苯乙醇类产物中的应用。
技术介绍
光学纯的1-苯基乙醇类化合物，尤其是α卤素取代的1-苯基乙醇类化合物是药物及其他精细化学品合成过程中的重要手性中间体。目前多种获取光学纯的手性纯的方法被开发出来，包括动力学拆分与不对称合成两大类。利用前手性羰基化合物不对称合成方法的理论收率可达100％，是获取光学纯的1-苯基乙醇类化合物的重要途径。科研人员已经通过手性金属配体作为催化剂，开发出合成光学纯的手性醇的化学合成方法，并部分应用于工业生产，然而，由于其条件苛刻且存在重金属残留问题，在药物等合成中的应用受到了限制。生物催化以其环境友好、反应条件温和、区域及立体选择性高等优势，在手性醇的合成中受到了越来越多的关注。自然界中存在的酮还原酶或醇脱氢酶大多是以符合Prelog规则的立体选择性来催化不对称还原产生一种构型的手性醇，然而在药物及化工合成中，两种构型的醇均是重要的合成中间体，因而限制了酮还原酶或醇脱氢酶在工业中的应用。例如符合Prelog规则的R-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇是合成胆固醇吸收抑制剂的手性中间体；符合反Prelog规则的R-1-(3,5-双三氟甲基苯基)乙醇是合成抗肿瘤辅助用药阿瑞匹坦的手性中间体。为改善酮还原酶或醇脱氢酶在不对称催化合成光学纯的1-苯基乙醇类化合物过程中的实用性，通过蛋白质理性设计及定向进化方法改变酶催化性质的方法被越来越多的研究人员用来改造酮还原酶或醇脱氢酶的立体选择性。于洪伟等通过同源酶的结构指导，将来源于恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaATCC12633)的短链脱氢酶(PpYSDR)立体选择性改造为符合反Prelog规则，针对底物2,2,2-三氟-1-苯基乙酮突变体PpYSDR-M85T/W182V立体选择性由野生型的56.8(R)改变为99.5(S)(Chem.Commun.,2016,52,6284)；游松等通过蛋白质结构及计算机模拟辅助的方法将来源于光滑假丝酵母(CandidaglabrataCGMCC2.234)的酮还原酶(CgKR1)改造为符合反Prelog规则的催化性质，针对底物2-氯-1-苯基乙酮突变体CgKR1-F92A立体选择性由野生型的23.1(R)改变为99.1(S)(ACSCatalysis,2016,6(9):6135-6140.)。本实验室通过基因挖掘获取的来源于发酵乳酸杆菌的短链脱氢酶LfSDR1，野生状态下对苯乙酮表现出较差的立体选择性，例如催化还原底物2-氯-1-苯基乙酮得到相应醇的对映体过量值(ee)仅64.4(S)。通过理性设计及蛋白质定向进化提高及逆转该酶的立体选择性，实现不同构型的光学纯的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。
技术实现思路
：本专利技术目的在于解决现有发酵乳酸杆菌短链脱氢酶(LfSDR1)立体选择性低及立体选择性单一的问题，通过定点突变，获取该酶突变体、编码突变体的核酸、含有该核酸的重组表达载体及重组表达转化体，重组突变体酶催化1-苯基乙酮类不对称还原，制备相应相反构型(R和S构型)光学纯的手性醇中的应用。为解决上述问题，本专利技术首先采取定点突变的技术，获取立体选择性改变的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白。为了提高野生型的立体选择性，对序列表中具有如SEQIDNo.2所示氨基酸序列进行突变，将186位的缬氨酸(V)分别突变为具有较大空间位阻的氨基酸，所述的较大空间位阻的氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，优选为苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)，从而获取具有羰基还原活性的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白、分别命名为LfSDR1-V186F(SEQIDNo.4)与LfSDR1-V186W(SEQIDNo.6)，以催化还原2-氯-1苯基乙酮为例，立体选择性由野生型的64.4％(ee，S)分别提高到99.9％(ee，S)与90.4％(ee，S)。进一步地，将94位脯氨酸突变为疏水性氨基酸，所述的疏水性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为缬氨酸；更进一步地，将192位异亮氨酸突变为疏水性氨基酸，所述的疏水性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为缬氨酸。为了逆转野生型的立体选择性，对序列表中具有如SEQIDNo.2所示氨基酸序列进行突变，将186位的缬氨酸(V)分别突变为具有较小空间位阻的氨基酸，将141位谷氨酸突变为非极性氨基酸，将92位甘氨酸突变为具有较大位阻的氨基酸或极性氨基酸；所述较小空间位阻的氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸，优选为丙氨酸(A)，所述的非极性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为亮氨酸(L)，所述的较大位阻的氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，优选为苯丙氨酸(F)，所述的极性氨基酸为：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺，优选为谷氨酸(E)。优选地，将186位的缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，将141位谷氨酸突变为亮氨酸(L)，将92位甘氨酸突变为苯丙氨酸(F)，获取突变体LfSDR1-V186A-E141L-G92F(SEQIDNo.8)，更优选地，将186位的缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，将141位谷氨酸突变为亮氨酸(L)，将92位甘氨酸突变为谷氨酸(E)，获得突变体LfSDR1-V186A-E141L-G92E(SEQIDNo.10)。以催化还原2-氯-1苯基乙酮为例，突变体的立体选择性由野生型的64.4％(ee，S)分别逆转为97.2％(ee，R)与99.9％(ee，R)。所述突变体获得方法具体过程如下：为获取立体选择性提高的突变体，以野生型短链脱氢酶LfSDR1基因(SEQIDNo.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取突变点上下游各15-20bp的碱基，将突变点的碱基替换成突变后氨基酸的密码子作为PCR正向引物，其反向互补序列作为反向引物)，通过PCR扩增获得突变体LfSDR1-V186F与LfSDR1-V186W基因。为获取立体选择性逆转的突变体，以野生型短链脱氢酶LfSDR1基因(SEQIDNo.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取突变点上下游各15-20bp的碱基，将突变点的碱基替换成突变后氨基酸的密码子作为PCR正向引物，其反向互补序列作为反向引物)，通过PCR扩增获得突变体LfSDR1-V186A-E141L-G92F与LfSDR1-V186A-E141L-G92E基因。进一步，将突变体基因及载体质粒pET22b以内切酶NdeⅠ与XhoⅠ进行双酶切(37℃反应4-8h)，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4DNA连接酶将经过双酶切的突变基因片段及载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET22b-LfSDR1-V186F、pET22b-LfSDR1-V186W、pET22b-LfSDR1-V186A-E141L-G92F与pET22b-LfSDR1-V186A-E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种短链脱氢酶，其特征在于，所述的短链脱氢酶及其突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2一致或具有80％以上序列一致性。

【技术特征摘要】
1.一种短链脱氢酶，其特征在于，所述的短链脱氢酶及其突变体的氨基酸序列与SEQIDNO.2一致或具有80％以上序列一致性。2.一种短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQIDNo.2基础上将186位缬氨酸突变为具有较大空间位阻的氨基酸，所述的较大空间位阻的氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，优选为苯丙氨酸或色氨酸。3.如权利要求2所述的一种短链脱氢酶突变体，其特征在于，将94位脯氨酸突变为疏水性氨基酸，所述的疏水性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为缬氨酸。4.如权利要求3所述的一种短链脱氢酶突变体，其特征在于，将192位异亮氨酸突变为疏水性氨基酸，所述的疏水性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为缬氨酸。5.如权利要求2所述的一种短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQIDNo.2基础上将186位缬氨酸突变为具有较小空间位阻的氨基酸，将141位谷氨酸突变为非极性氨基酸，将92位甘氨酸突变为具有较大空间位阻的氨基酸或极性氨基酸；所述的较小空间位阻的氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸，优选为丙氨酸，所述的非极性氨基酸为：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，优选为亮氨酸，所述的具有较大空间位阻的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，优选为苯丙氨酸，所述的极性氨基酸为：谷氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：游松，秦斌，秦凤玉，郭继阳，刘亚林，张飞霆，张文鹤，祝天慧，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21