本发明专利技术公开了一种异亮氨酸双加氧酶突变体及其应用，属于分子生物学的技术领域。本发明专利技术结合易错PCR技术和DNA定点突变技术，对去掉了N端2‑7位六个氨基酸残基的野生型异亮氨酸双加氧酶IdoΔ6编码基因进行分子改造，得到了两个突变酶IdoΔ6N126H和IdoΔ6N126H/T130K，突变体酶与底物的亲和性为野生型的1.6～4.6倍，催化效率是野生型的2.4～2.8倍。利用突变体酶IdoΔ6N126H/T130K合成4‑HIL产量提高了2.5倍，解决了在4‑HIL合成过程中，酶的催化效率低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成4‑HIL创造好的条件。
Isoleucine double oxygenase mutant and its application
The invention discloses an isoleucine dioxygenase mutant and its application, belonging to the technical field of molecular biology. By combining error-prone PCR technique with DNA site-directed mutagenesis technique, the coding gene of wild-type isoleucine dioxygenase Ido6 was modified to obtain two mutant enzymes IdoN126H and IdoN126H/T130K. The affinity of the mutant enzyme to the substrate was 1.6-4.6 times that of the wild-type. The catalytic efficiency is 2.4 to 2.8 times that of the wild type. The yield of 4_HIL synthesized by the mutant enzyme Ido6N126H/T130K was increased by 2.5 times. The problem of low catalytic efficiency of the enzyme in the process of 4_HIL synthesis was solved, and good conditions were created for the biosynthesis of 4_HIL by the enzyme and its coding gene.
【技术实现步骤摘要】
一种异亮氨酸双加氧酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种异亮氨酸双加氧酶突变体及其应用，属于分子生物学的
技术介绍
定向进化属于非理性设计，是指在不了解酶分子相关的空间结构、催化机制的情况下，通过人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化的机制(随机突变、重组以及自然选择)，通过体外建立突变库，利用高通量定向筛选方法获得所需要的有价值的突变酶。近十年来，定向进化技术已经在酶的相关性质改造领域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改进底物特异性，提高热稳定性等方面。定点突变(site-directedmutagenesis)属于理性设计，是指对目的基因的指定位点进行碱基替换、饱和突变、缺失、或者插入，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。它是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。而将两种技术结合后有可能起到更好的效果。在通过定向进化技术筛选得到具有效果的重要氨基酸位点后，然后结合对其它重要位点进行定点突变，将有助于进一步改进酶分子的结构和功能，并了解这些位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用，所以理性设计和非理性设计的合理结合是蛋白质改造的一种重要技术手段。异亮氨酸双加氧酶(isoleucinedioxygenase，简称IDO)以L-异亮氨酸(L-isoleucine，简称Ile)、α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，简称α-KG)和氧气为底物，催化Ile发生羟基化，生成4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，简称4-HIL)，同时将α-KG转变成琥珀酸。IDO仅存在于芽孢杆菌等少数物种中，但是它们的序列不尽相同。并且成熟的IDO酶的N端会去掉几个氨基酸残基，相对于未去除几个氨基酸残基的新生IDO酶，其稳定性和催化活性都有所提高。生物学中一般将IDO用于Ile的生物转化以合成4-HIL。4-HIL是一种天然的非蛋白氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素的抵抗，调节血脂异常等生理功能，在治理糖尿病及其并发症方面有潜在的应用价值。目前4-HIL的主要生产方法是生物转化法，IDO是4-HIL生物转化的关键酶，但是经研究发现IDO的热稳定性和pH稳定性不高，并且酶的催化效率低，这会使利用该酶生物合成4-HIL受到限制，导致4-HIL的产量偏低。为了近一步提高4-HIL的产量，因此需要对IDO酶进行改造，提高酶的活性和催化效率，为利用该酶及其编码基因来生物合成4-HIL创造好的条件。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种异亮氨酸双加氧酶突变体，含有SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供编码所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因含有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因含有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供携带所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因的载体。本专利技术的第四个目的是提供表达所述异亮氨酸双加氧酶突变体的细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。本专利技术的第五个目的是提供一种基因工程菌，表达所述异亮氨酸双加氧酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，以pET系列质粒为表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是将SEQIDNO.2和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)或能表达该酶的菌株中表达。在本专利技术的一种实施方式中，异亮氨酸双加氧酶基因ido来自韦氏芽孢杆菌(Bacillusweihenstephanensis)，核苷酸序列见SEQIDNO.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌按如下方法构建：第一，以来自B.weihenstephanensis的异亮氨酸双加氧酶基因idoΔ6为模板，通过易错PCR获得随机突变文库，采用纸层析筛选和粗酶液酶活测定两步筛选法获得所需要的突变酶，扩大培养，表达、纯化后得到了突变酶IdoΔ6N126H，并测定其酶学性质；第二，以第一步筛选得到的突变体基因为模板，进行T130K定点突变，构建突变体，以质粒pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单菌落进行扩大培养，表达、纯化后得到突变酶IdoΔ6N126H/T130K。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌的表达单元的启动子为常用的T7启动子，在T7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coliBL21(DE3)中，完成胞内的可溶性表达。本专利技术的第六个目的是提供一种提高异亮氨酸双加氧酶催化效率的方法，是将ido基因(Genbank登录号ABY46544.1)编码的氨基酸序列基础上，去掉N端2～7位的六个氨基酸残基，将第126位的天冬酰胺替换为组氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还将第130位的苏氨酸替换为赖氨酸。本专利技术的第七个目的是提供一种生产4-羟基异亮氨酸的方法，所述方法以L-异亮氨酸、α-酮戊二酸为底物，应用所述基因工程菌为催化剂进行催化反应。本专利技术还提供所述异亮氨酸双加氧酶突变体在制备含4-羟基异亮氨酸或琥珀酸的产品方面的应用。有益效果：本专利技术通过比较野生酶IdoΔ6和突变酶IdoΔ6N126H、IdoΔ6N126H/T130K的酶学性质，发现，突变体酶IdoΔ6N126H与底物的亲和性为野生型的4.6倍，催化效率是野生型的2.8倍；突变体酶IdoΔ6N126H/T130K与底物的亲和性为野生型的1.6倍，催化效率是野生型的2.4倍，并且突变体酶IdoΔ6N126H/T130K的活性相比于对照提高了10％。利用突变体酶IdoΔ6N126H/T130K合成4-HIL产量提高了2.5倍。附图说明图1为重组质粒pET28a(+)-idoΔ6的构建图谱。图2为随机突变筛选到的5株菌株粗酶液比活力图。图3为突变菌株和对照菌株24h内全细胞转化生成4-HIL的折线图。具体实施方式所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌JM109、BL21(DE3)菌株购自天根生物公司；引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；Ni-NTAAgarose购自QIAGEN公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。异亮氨酸双加氧酶的酶活测定：反应体系为1mL：先加入200μL缓冲液(500mMNa2HPO4，250mM柠檬酸以一定比例混合；pH5.96)、再加入30mMIle、30mMα-KG、5mM抗坏血酸、1mMFeSO4、之后加入30μL的纯化完的蛋白液，最后加水补齐。30℃下在恒温水浴摇床上震荡反应1h，反应结束后用沸水浴5min终止反应，取750μL反应液加入250μL三氯乙酸(20％)，置于4℃下沉淀蛋白4h以上，再离心20min，用水相滤膜过滤之后用于HPLC分析，测定4-HIL的含量。一个酶的活性单位(U)定义：在测定条件下，每分钟生成1mol4-HIL所需的酶量本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种异亮氨酸双加氧酶突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种异亮氨酸双加氧酶突变体，其特征在于，含有SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因的载体。4.表达权利要求1所述异亮氨酸双加氧酶突变体的细胞。5.一种基因工程菌，其特征在于，表达所述异亮氨酸双加氧酶突变体。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET系列质粒为表达载体。7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，将SEQIDNO.2...
【专利技术属性】
技术研发人员：史锋，黄森，李永富，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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